[发明专利]一种微生物催化去消旋化制备L-草铵膦的方法

说明书

本发明公开了一种微生物催化去消旋化制备L‑草铵膦的方法，该方法以DL‑草铵膦为原料，解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX‑2全细胞中的D‑氨基酸氧化酶催化D‑草铵膦氧化脱氨为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸，L‑草铵膦保留。细胞中共表达的氨基酸脱氢酶催化2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸原位还原氨化为L‑草铵膦，从而实现DL‑草铵膦的完全去消旋化。制备的L‑草铵膦无其他副产物，总收率70％，光学纯度99％。

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，涉及一种解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XX-2用于制备L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦是一种手性除草剂，有L-和D-两种对映体。其中，L-草铵膦除草活性是消旋体的2倍。草铵膦以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于降低使用成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。

L-草铵膦的制备方法主要包括化学法和生物法。相比于化学法，生物法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化的优点，是实现L-草铵膦工业化生产最具潜力的方法。

生物法包括生物不对称合成法和生物拆分法。

生物不对称合成法主要包括氨基酸脱氢酶法和转氨酶法。氨基酸脱氢酶法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，草铵膦脱氢酶/甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌为生物催化剂，在辅酶NADP⁺和辅底物甲酸铵存在下制备L-草铵膦(ZL 201710195364.3，CN108588045A)。该方法中不仅L-草铵膦收率低，光学纯度不高，而且辅酶NADH需再生，难以在工业化生产中应用。转氨酶法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，在氨基供体如丙氨酸存在的条件下，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物与氨基供体发生转氨反应，得到L-草铵膦，转化率85-100％，ee99.9％(ZL201610045121.7，CN 108660167A)。由于转氨化是一个可逆反应，存在两个L-氨基酸和两个α-酮酸的反应平衡，分离难度大。

生物拆分法主要包括以N-乙酰-DL-草铵膦为原料，以含羧肽酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，制备L-草铵膦。D-N-乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分(CN 108690854 A)以及以2-氨基-4-(羟基甲基磷酰基)丁腈为原料的腈水解酶拆分法(ZL201310201317.7)。生物拆分法的理论收率为50％。通常情况下，生物拆分法需要以衍生的DL-草铵膦为原料，涉及无效对映体的化学消旋和循环拆分。

夏仕文等(CN105567780A)公开了一种L-草铵膦的酶-化学催化去消旋化制备方法。该方法采用固定化D-氨基酸氧化酶-钯碳/甲酸铵组合体系实现DL-草铵膦去消旋化，L-草铵膦收率90％，ee99％，但制备成本偏高。杨立荣等(CN107502647 A)公开了一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，该方法以DL-草铵膦为原料，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；而2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸又被氨基酸脱氢酶催化还原为L-草铵膦，进而实现了DL-草铵膦的原位去消旋化，得到的L-草铵膦中无其他副产物，产品总收率99％，光学纯度可超过99％。

开发一种简捷、高效、低廉、绿色的生物催化去消旋化方法将是今后生产L-草铵膦的重要突破口和发展方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物催化去消旋化制备L-草铵膦的方法。采用“一锅煮”反应方式，以未经衍生的DL-草铵膦为原料，利用微生物细胞中的D-氨基酸氧化酶对映选择性催化DL-草铵膦中的D-对映体氧化脱氨为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，L-草铵膦完全保留。利用细胞中共表达的氨基酸脱氢酶体系将2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸原位还原氨化为L-草铵膦，通过生物氧化脱氨-生物还原氨化实现DL-草铵膦的去消旋化。