[发明专利]一种用于在复杂基质中检测活性蓖麻毒素的金/量子点纳米探针及其应用

说明书

本发明公开了一种用于在复杂基质中检测活性蓖麻毒素的金/量子点纳米探针及其应用。所述金/量子点纳米探针是利用脱氧核糖核苷酸单链(ssODN)修饰的金纳米微粒和量子点通过碱基配对杂交的方式形成脱氧核糖核苷酸双链，将金纳米微粒和量子点组装为核‑卫星结构的纳米探针。本发明用金/量子点纳米探针用于检测活性蓖麻毒素，检测限为7.46ng/mL，准确度高，可靠性好，而且无须大型设备和复杂操作。为进一步消除假阳性，本发明还提供了一种利用磁性微球富集复杂样品中蓖麻毒素的方法。在不需要知道具体活性蓖麻毒素浓度的情况下，本发明提供的金/量子点纳米探针通过荧光的淬灭(Quenched)和激活(Switch ON)，可以做到裸眼可视化的检测。

技术领域

本发明涉及一种天然毒素的检测方法，具体涉及一种活性蓖麻毒素的快速、可视化的 简便检测方法，以及用于该方法的金/量子点纳米探针。

背景技术

蓖麻毒素(ricin)是一种高致命的天然毒素，属Ⅱ型核糖体失活蛋白，相对分子质量约为64,000Da，由A、B两条多肽链通过一个二硫键相连而成，具有极高的细胞毒性 (其毒性是有机磷神经性毒剂VX的385倍、氰化物的6000倍、肉毒毒素的10000倍)， 可通过吸入、口服或静脉注射途径致使机体严重中毒。蓖麻毒素广泛存在于植物蓖麻的种 子中，具有提取容易、性质稳定、施毒简便等特点，目前尚缺乏对其有效的预防或治疗手 段，因此频频被用于暗杀和恐怖袭击活动。因为其特性，在《禁止化学和生物武器公约》 的控制清单1中，蓖麻毒素是唯一的蛋白质类毒素。已有的食品和环境样本中蓖麻毒素的 检测方法包括免疫检测法(酶联免疫分析和胶体金免疫检测试纸)和质谱检测法，前者虽然 灵敏度较高，但存在较高假阳性率；后者能够实现蓖麻毒素的确证和定量分析，但对仪器 设备高度依赖，不适合应急保障现场的快速检测。而且，以上技术均不能确定样品中的毒 素是否仍具有生物活性。与化学战剂只需要进行快速的定性、定量分析不同的是，在对这 一类生化战剂的实际监测过程中，一旦染毒样品被确定含有蓖麻毒素，人们最终关心的问 题是其是否具有生物活性(毒性)，是否会对人员健康造成威胁。2009年，由德国Robert Koch研究所主办的第一届蓖麻毒素国际联试总结报告明确指出：如何检测活性蓖麻毒素 是亟需解决的难点问题。

在蓖麻毒素的活性分析研究中，早期主要采用基于动物实验测定LD50以及细胞毒性 实验测定IC50的方法，这些方法繁琐耗时、条件苛刻，无法完成实际样品中残留毒素的活性检测，故目前仅用作表征毒素活性的常规方法。随着人们对蓖麻毒素认识的不断深入，近年发展了一些新型活性分析方法。蓖麻毒素的致毒机理可以概括为：具有凝集素活性的毒素B链含有两个半乳糖残基结合位点，可同细胞表面含半乳糖残基的糖蛋白或糖知结合，促进毒素分子内陷进入细胞，链间二硫键经还原游离出A活性链，A链发挥N-糖苷酶活 性致使核糖体60S亚单位的28S rRNA的特定部位腺嘌呤水解，导致核糖体失活，继而抑 制蛋白质合成引发细胞死亡。基于这一机理，一些报道试图通过对蓖麻毒素A链糖苷酶活 性检测实现活性鉴定，其基本思路为：通过在体外条件下将蓖麻毒素与核糖体RNA或具有 特定结构的寡核苷酸底物(RNA或DNA)孵育，利用质谱定量测定脱嘌呤反应释放出腺嘌呤 的量，或将腺嘌呤经酶等作用经多步衍生后进行放射性标记、比色或荧光检测，实现对蓖 麻毒素活性的间接评价。这些方法均能够较好地应用于毒素的活性分析，且定量准确、灵 敏度高，但由于方法存在仪器昂贵、步骤繁琐、技术性强等局限性，难以适用于战争及突 发事件等特殊环境下对活性毒素的现场快速侦检。

Tang等(ACS Appl.Mater.Interfaces.2016,8,2449-2455)公开了一种基于利用ricin与连接在表面增强拉曼散射(SERS)基底上的特异性寡核苷酸底物poly-21dA间脱嘌呤反应构建传感体系。poly-21dA自身的拉曼信号很强可作为拉曼报告原件，同时又作为SERS检测的特异性反应元件。基于ricin浓度和SERS强度二者良好的线性相关性，可实 现对ricin的高灵敏度检测。该方法可以实现对自来水，果汁，稀释的血清样品中活性蓖 麻毒素的快速表面增强拉曼检测，但是无法应用于食品等更为复杂的基质中低灵敏度的活 性毒素检测，在基质适用性和灵敏度上仍有较大的提高空间。