[发明专利]一种用于PCR扩增的畜禽粪便总DNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种用于PCR扩增的畜禽粪便总DNA的提取方法，包括如下步骤：(1)采集新鲜畜禽粪便样品或冻存的粪便样品为材料，制备菌体悬浮液；(2)取所述菌体悬浮液，加入异硫氰酸胍裂解液进行初步裂解，然后离心；(3)离心后取上清液，转入SDS提取液中，然后离心取沉淀；(4)将所得沉淀用SDS裂解液再次裂解，裂解后经离心、洗涤即得总DNA。本发明的方法可快速、简便、经济、低毒、易行的从畜禽粪便中提取总DNA。

技术领域

本发明涉及一种从猪粪便样品中提取总DNA的方法，属于微生物学和分子生物学技术领域。

背景技术

目前，畜禽粪便污染问题已成为当前农业面源污染的主要污染源之一。作为“人畜共患病”传播载体畜禽粪便，含有大量的致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪流感病毒、禽流感病毒等。因此，有必要对畜禽粪便中的致病菌种类和数量进行检测。

例如，公开号为CN 108760954A的中国发明专利申请公开了一种用于检测畜禽粪便样本中多种真菌毒素的方法，将样本经β-葡萄糖醛酸酶酶解之后，经乙腈/水溶液(84/16，v/v,含10％NaCl)超声提取、离心、浓缩、复溶后直接在TQS三重四级杆液相色谱串联质谱仪中以甲醇和5mmol/L醋酸铵的水溶液(含0.1％甲酸)作为流动相进行梯度洗脱分析，15种真菌毒素能够达到有效分离。公告号为CN 208234910U的中国实用新型专利公开了一种粪便病菌分离与检测装置，其中：外壳两侧壁之间通过螺栓固定安装有支撑板，支撑板内设有轴孔，离心电机通过安装板固定安装在支撑板的下表面处，转轴的底端与离心电机的输出端固定连接，且转轴的顶端从轴孔贯穿并从支撑板的上表面穿出，并与离心片固定连接，离心片之上设有离心管槽，离心管槽的两侧内设有卡槽，离心管架套在离心管的开口处，且离心管架两侧设有凸起结构，凸起结构置于卡槽内。

随着现代分子生物学技术的发展及其在微生态学研究中的应用，人们可以直接从DNA水平上对这些致病菌群进行相关研究，然而，获得高质量、具有代表性的致病菌群总DNA就成为这些研究的前提和重要技术手段。粪便组成成分复杂(含有腐殖酸、重金属离子等PCR的强抑制物)、细菌类型繁多，而不同细菌因其各自独特的细胞壁成分和结构，又对不同的提取方法的敏感程度有所差异，从而导致了不同方法的提取效率不尽相同，因此，迫切需要寻找一种快速、方便、高效的粪便基因组DNA的提取方法。

发明内容

本发明提供一种快速、简便、经济、低毒、易行的畜禽粪便DNA提取方法。

一种用于PCR扩增的畜禽粪便总DNA的提取方法，包括如下步骤：

(1)采集新鲜畜禽粪便样品或冻存的粪便样品为材料，制备菌体悬浮液；

(2)取所述菌体悬浮液，加入异硫氰酸胍裂解液进行初步裂解，然后离心；

(3)离心后取上清液，转入SDS裂解液中，然后离心取沉淀；

(4)将所得沉淀用SDS裂解液再次裂解，裂解后经离心、洗涤即得总DNA。

优选地，所述异硫氰酸胍裂解液为5mol/L异硫氰酸胍裂解液。配方为：4.77g异硫氰酸胍，20mL 0.1M Tris-HCl(pH6.4)，4.4mL 0.2M EDTA(pH8.0)。

优选地，所述SDS裂解液的配方：45mM Tris-氯化钠(pH8.1)，1％SDS，1mM磷酸盐缓冲液(pH7.0～7.5)，0.02mMβ-甘油磷酸酯，0.01mM邻戊酸钠，0.01mM氟化钠，1mM EDTA，0.01mMβ-巯基乙醇。

本发明的提取方法，在样品的前处理过程中采用异硫氰酸胍裂解与SDS裂解串联，异硫氰酸胍裂解去掉样品中的腐殖酸，SDS裂解液中含有多种阴、阳离子抑制剂，去除样品中的重金属。两级裂解串联、分级去除样品中的各种杂质，提高DNA提取效率和纯度。

优选地，步骤(1)中制备菌体悬浮液的方法如下：