[发明专利]一种线性化载体自重组的质粒构建方法

说明书

本发明提供了一种简便的细菌体内线性化载体自重组的质粒构建方法，包括如下步骤：1)合成带有目的片段的引物对；2)应用上述引物，以质粒空载体为模板进行PCR扩增；3)PCR产物纯化回收，得到含目的片段的线性化载体；4)转化，线性化载体在细菌体内重组获得质粒。其中步骤1)所述引物每条含有2部分：第1部分是能与质粒载体互补的序列，位于引物3′端，第2部分是含目的片段的组合片段，位于引物5′端；所述引物对中两条引物的“第2部分”包含10‑15bp的反向互补序列。本发明步骤精简、耗时少，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种质粒构建方法。

背景技术

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术，其原理依赖于限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶和其它修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

现有的构建质粒的技术通常使用双酶切——连接方法，即在目的片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点，然后使用限制性内切酶处理，从而产生相同的黏性末端。

技术流程首先是通过PCR方法大量扩增出目的片段，通过酶切获得目标连接末端(一般针对大于150bp的片段)，或者合成反向互补的两条单链寡核苷酸，梯度退火获得双链(一般针对小于150bp的片段)；然后应用内切酶酶切的方法处理质粒载体，使其带有可以与目的片段互补的末端，再通过T4DNA连接酶进行连接反应，得到带有目的片段的载体；最后通过转化，使质粒进入原核细胞内扩增，从而得到足量的带有目的基因的质粒。

当前已经出现针对大于150bp目的片段设计连接端同源序列，体外应用同源重组酶进行质粒构建的方案，该方案不再受内切酶使用的限制。但是小于150bp目的片段的克隆方案还受制于退火效率、内切酶效率、T4DNA连接酶效率等问题。小于150bp的单链寡核苷酸链，随着长度的增加，合成效率和纯化难度随之增加，特别是大于100bp的时候，当前技术条件下保真度也存在问题。

此外，酶切法需要使用限制性内切酶以及T4 DNA连接酶，成本较高，过程繁琐，实验周期长。酶切法还会依赖内切酶和连接酶的效率，当两者中任意一个效率不高时，就会导致带有目的基因的质粒的产率低下(图1)。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种线性化载体自重组的质粒构建方法，包括如下步骤：

1)合成各包含目的片段一半序列+5～8bp长度的引物对；

2)使用上述引物，以质粒载体为模板进行PCR扩增；

3)PCR产物纯化回收，得到两端带有部分目的片段的线性化载体；

4)转化，在细菌体内自重组为质粒。

步骤1)所述引物每条含有两部分：第1部分是能与质粒载体互补的序列，位于引物3′端；第2部分是插入片段，位于引物5′端；

所述引物对中两条引物的“第2部分”的5′端具有10-15bp的反向互补序列。

进一步地，步骤1)所述引物对中两条引物的“第2部分”的5′端具有12bp的反向互补序列。

进一步地，所述质粒载体带有标记基因。

进一步地，所述标记基因是抗生素抗性基因。

进一步地，所述细菌是质粒扩增用的大肠杆菌。