[发明专利]一种分析重组人胰岛素及其类似物或偶联物与胰岛素受体结合率的方法

说明书

本发明公开了一种分析人胰岛素及其类似物或偶联物与胰岛素受体结合率的方法，首先胰岛素受体转染到HEK‑293细胞上；人胰岛素受体的抗体包被在酶标板上，胰岛素受体抗体结合胰岛素受体，人胰岛素及类似物或偶联物和生物素标记胰岛素竞争结合胰岛素受体，亲和素结合生物素，通过HRP显色测定受体结合率。本发明利用抗原抗体结合、配体受体结合、生物素能结合亲和素的原理可准确地测定胰岛素受体结合率变化，本发明已具有生物制品受体结合实验测定方法的操作步骤简便、无污染、低成本、准确性高等要求。

技术领域

本发明涉及胰岛素受体结合率体外药效学实验检测技术领域，具体涉及重组人胰岛素类似物或偶联物受体结合率体外药效学实验检测技术领域，包括速效胰岛素如门冬胰岛素 (Insulin aspart)、赖脯胰岛素(Insulin Lispro)、赖谷胰岛素(InsulinGlulisine)，长效胰岛素如甘精胰岛素(Insulin glargine)、地特胰岛素(InsulinDetemir)、德谷胰岛素(Insulin Degludec)以及修饰偶联物如聚乙二醇化胰岛素(如PEG-Lispro， PEG-Insulin)和PEG-Insulin(PEG conjugated des B30-insulin)与人胰岛素受体结合率测定方法。

背景技术

胰岛素是由51个氨基酸组成的双链(A、B链)蛋白激素，分子量为5374，等电点5.35， A链含有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。两条肽链之间由两个二硫键连接，A链的第6和第11位氨基酸残基之间也由二硫键相连。胰岛素是通过胰岛素受体发挥降低血糖作用，胰岛素受体主要分布在肝细胞、肌细胞、脂肪细胞的细胞膜上，主要促进靶细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进靶细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞，转变为脂肪酸作为糖原贮存，同时加速氧化葡萄糖为高能磷酸化合物作为能量的来源，从而使血糖水平下降，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。胰岛素作为糖尿病治疗的主要药物，可有效调节人体血糖水平。

胰岛素受体是一个跨膜糖蛋白，胰岛素受体是由一对α亚基和一对β亚基所组成的异质性四聚体。两个α亚基之间和两个β亚基之间有多个二硫键(S-S)连接，是同型二聚体结构。α亚基和β亚基的分子质量分别为l35000和95000。单链胰岛素受体加前体由1382 个氨基酸组成(154kDa)。α亚基由735(84kDa)个氨基酸残基组成，位于细胞外表面，它能结合胰岛素分子，结合部位主要在富含胱氨酸结构域；β亚基由620(70kDa)个氨基酸残基组成，β亚基跨膜，分为三个结构区域：194个氨基酸残基组成的N端区域暴露在细胞表面，通过二硫键与a亚基相连，由23～26个疏水性很强的氨基酸残基组成的跨膜区域以及由403个氨基酸残基组成的C端区域。β亚基则穿过细胞膜.小部分在细胞膜外.大部分在细胞膜内，主要起生物效应作用。单链胰岛素受体的信号肽是由27个氨基酸组成。全长的胰岛素受体的单链序列是(1-1382个氨基酸)。

胰岛素受体分为2个亚型IR-A和IR-B。胰岛素受体由于mRNA第11外显子剪接方式的不同，IR存在两种亚型(isoform)。外显子11编码12个氨基酸(717－728),插在 IR-B型的膜外α亚基倒数第3个氨基酸残基上游。而IR-A(Exon11-)缺失这12个氨基酸。有外显子11编码的肽，形成的受体具有不同的化学性质。这两种亚型对胰岛素具有相类的亲和力，这两种亚型也具有不同的激酶活性，不同的内化和循环速度。这两种亚型定位于质膜不同的区域，通过激活不同类型的PI3K，调控胰岛素和β-葡糖激酶基因表达。

众所周知，生物药品的生物活性测定是通过测定配体和受体结合后产生的增殖、凋亡、第二信使cAMP、磷酸化和转运葡萄糖等生物效应实现的，但生物活性都是在活细胞水平上的，研究相对客观，为了更为直观的研究生物药物体外药效学，生物类药品需要测定受体和配体的结合率来反映药物的初步药效。