[发明专利]一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法

说明书

本发明提供了一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法，属于天然蛋白酶提取技术领域。通过发芽技术提高辣木籽的蛋白酶种类和含量,然后根据辣木籽蛋白质组学解析，得到上调表达且具有水解活性的蛋白酶的信息，用于指导后续提取。本发明提供的提取方法不仅能够提取得到多种具有水解活性的蛋白酶，并且提取得到的蛋白酶含量高、酶活性强。从发芽辣木籽提取得到的8种辣木籽蛋白酶相比从干辣木籽中提取的蛋白酶含量相应提高了10％～21％，其中2种蛋白酶相比干辣木籽蛋白酶相应水解活力提高了8.0％～9.9％。采用本发明提供的的方法，避免了传统蛋白质分离方法的盲目性、繁琐性和工作量大的问题，具有操作简便重复性好的特点。

技术领域

本发明属于天然蛋白酶提取技术领域，具体涉及一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法。

背景技术

随着酶工程在食品工业中得到了越来越广泛的应用，蛋白酶资源的需求量也越来越大。尽管可以通过基因工程、人工合成或微生物发酵等手段获得蛋白酶，但对天然动植物蛋白酶资源依然需求量较大，特别是一些具有水解活性的蛋白酶存在严重短缺的问题。

辣木树是多年生热带、亚热带落叶乔木，属被子门辣木科辣木属植物，拉丁学名为Moringa oleifera Lam.，英文名称为Moringa，另外还有多种别名，根据其豆荚形状(细长、呈三角形)，称为鼓槌树(Drumstick tree)，根据其根部具有辛辣味，称为辣根树(Horseradish tree)；根据其籽实可榨油，称为奔油树(Ben oil tree或者Benzoil tree)。辣木是云南特色优势产业，资源丰富，辣木籽的种子和叶子中含有丰富的营养成分，但辣木籽本身含有生物碱、辣木黄酮，高血压、糖尿病患者及孕妇等最好经医师指示后酌量食用。目前，有关辣木及其附属品的食用或药用价值报道较多，然而对蛋白酶及其生物活性的研究却鲜有报道，更没有一种关于如何提取高含量、高水解活性的蛋白酶的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法，采用所述方法提取的蛋白酶不仅含量高，而且水解活性强。

本发明提供的一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)从发芽辣木籽和干辣木籽中分别进行蛋白质非标记相对定量分析，筛选干辣木籽总蛋白和发芽辣木籽总蛋白之间的差异蛋白；发芽辣木籽的芽长为10～15cm，发芽辣木籽的质量为12.57～13.09g/15粒；干辣木籽的质量为4.31-4.53g/15粒；

2)统计步骤1)所述差异蛋白中上调表达的蛋白质，将得到的上调表达的蛋白质进行GO功能注释，得到具有水解活性的蛋白酶；

3)采用盐法提取发芽辣木籽蛋白酶，得到辣木籽蛋白酶盐提液；

4)根据步骤2)中筛选得到具有水解活性的蛋白酶的PI值，调整步骤4)中辣木籽蛋白酶盐提液的pH值至所述PI值，收集蛋白酶沉淀，复溶，脱盐，得到辣木籽蛋白酶粗提液；

5)根据步骤2)中筛选得到具有水解活性的蛋白酶的分子量，选择超滤膜对所述辣木籽蛋白酶粗提液中的蛋白进行超滤截留，收集目标分子量的蛋白酶，得到具有水解活性蛋白酶。

优选的，步骤1)中所述发芽辣木籽的培养方法将辣木籽用4～10℃水浸润，再在20～25℃的水中浸泡24～26h，得到的浸泡辣木籽在恒温恒湿的环境中培养；

培养第1～3天，培养温度为25～30℃、湿度为70％～75％；培养第4～6天，培养温度为22～25℃、湿度控制在60％～65％。

优选的，步骤2)中具有水解活性的蛋白酶包括8种蛋白酶；8种蛋白酶的氨基酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1～8所示；

所述SEQ ID No.1所示的蛋白酶的PI为10.10；所述SEQ ID No.1所示的蛋白酶的分子量为11789.27；