[发明专利]一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株、貉细小病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株，其特征在于，该毒株已于2018年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16627。

2.一种毒剂，其有效活性成分为权利要求1所述的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株。

3.一种貉细小病毒性肠炎灭活疫苗，其有效活性成分为权利要求1所述的一株貉细小病毒性肠炎病毒LN株。

4.制备权利要求3所述的貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、悬浮细胞复苏

对F81-TY株细胞进行复苏；

步骤二、悬浮细胞传代

将步骤一复苏后的F81-TY株细胞用低血清悬浮培养液进行扩大培养，得到F81-TY株细胞培养液；

步骤三、病毒摇瓶驯化

对貉细小病毒性肠炎病毒LN株进行培养驯化，筛选出用于悬浮培养的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种；

步骤四、病毒增殖培养

将步骤三驯化后的貉细小病毒性肠炎病毒生产毒种接种至步骤二得到的F81-TY株细胞培养液中，增殖后收获病毒液；

步骤五、制苗

利用步骤四得到的病毒液制备貉细小病毒性肠炎灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，按照步骤三、步骤一、步骤二、步骤四、步骤五的顺序进行疫苗制备。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤一的具体过程如下：

取液氮冻存的F81-TY株低血清全悬浮细胞，置于37℃水浴中快速解冻并接种于含有低血清悬浮培养液400mL的摇瓶中，血清浓度为1-5％，置于37℃、60rpm、5％(v/v)CO₂摇床培养72小时，待细胞密度达到8.0×10⁵个/mL以上，且细胞活力≥95％时，得到复苏后的F81-TY株细胞。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤二的具体过程如下：

(1)将步骤一复苏后的F81-TY株细胞按与低血清悬浮培养液体积比为1:4的比例接种于装有低血清悬浮培养液的摇瓶中，于37℃、60rpm、5％(v/v)CO₂摇床培养72小时；待悬浮细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％时，得到摇瓶生长的细胞悬浮液；

(2)将摇瓶生长的细胞悬浮液直接接种到工作体积5L的生物反应器中，接种体积为1000-2000mL，补加低血清悬浮培养液至5L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60-75rpm，温度为37℃，PH为7.1，培养36小时后，将溶氧设定为50％，继续培养36小时后的细胞培养液细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％；

(3)取步骤(2)中得到的细胞培养液3.5L转移至工作体积10L的生物反应器中，补加低血清悬浮培养液至10L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为75-85rpm，温度为37℃，PH为7.1，溶氧为70％，继续培养72小时后进行台盼蓝染色法计数及活力检测，当检测到的活细胞密度不低于7.5×10⁵个/mL时，即得到用于接毒的细胞培养液；

(4)将工作体积5L的生物反应器剩余细胞培养液1.5L补加低血清悬浮培养液至5L，按照步骤(2)和步骤(3)继续培养，作为细胞种子连续培养，得到F81-TY株细胞培养液。