[发明专利]一种减少调节性T细胞比例的培养方法

说明书

本发明公开了一种用于减少调节性T细胞(Treg)比例的培养基及其培养方法，本发明使用IL‑7及IL‑15细胞因子替代传统培养基中的IL‑2，所述培养基包含150ng/ml IL‑7、250ng/ml IL‑15、0.05mM硫代甘油、0.1mM N‑乙酰‑L‑半胱氨酸。所述培养方法包括如下步骤：分离外周血单个核细胞；Anti‑CD3与anti‑CD28抗体包被细胞培养瓶；使用所述培养基对T细胞进行体外扩增；离心收集T细胞。经14天的T细胞体外扩增培养，得到与传统IL‑2细胞因子培养方法相当的T细胞总数，其中调节性T细胞的比例可控制在1％以下。本发明可在保证T细胞杀伤肿瘤靶细胞功能的前提下，有效减少调节性T细胞在体外扩增T细胞中的产生，大幅降低肿瘤的治疗中免疫抑制的不良影响。

技术领域

本方法属于细胞培养领域。更具体地，本发明涉及一种减少调节性T细胞(Treg)比例的培养方法，用于细胞免疫治疗。

背景技术

CAR-T细胞免疫疗法，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigenreceptor T cell，CAR-T)。顾名思义，即通过基因工程技术，将肿瘤特异性抗原受体嵌合到人体免疫细胞T细胞上，使其能靶向肿瘤细胞特异性结合，激活T细胞杀伤肿瘤细胞。其核心技术是筛选到肿瘤特异性膜抗原，并通过高效基因工程转染技术，将抗原受体片段整合到人体T细胞上，使T细胞表达肿瘤抗原受体，起到肿瘤定向结合作用。CAR-T细胞治疗技术是一种肿瘤特异性的细胞免疫治疗技术，也是是现代肿瘤免疫治疗最新的免疫治疗技术之一。以CAR-T细胞免疫治疗技术为代表的肿瘤精准治疗也是2016年我国国家重点研发计划精准医学研究的重点研究方向之一。

在CAR-T的生产过程中，有一个关键步骤是将患者体内的T细胞进行体外扩增培养，达到符合治疗要求的剂量后回输到人体内，进行肿瘤的治疗。目前，CAR-T治疗实体肿瘤方面，多家机构发布的数据都表明了CAR-T在实体瘤治疗中的安全性，虽有部分报道了其疗效，但完全缓解率不及在血液肿瘤中取得的成绩。越来越多的实验数据表明，T淋巴细胞中有一群异质性的T细胞的存在，在肿瘤的治疗中起着免疫抑制的作用，这群细胞被称为调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)。调节性T细胞具有免疫抑制和免疫应答低下两大特征，发挥免疫负向调节作用抑制效应细胞的活性。根据作用机制及来源，调节性T细胞主要分为天然产生的CD4+CD25+Foxp3+Treg(nTreg)和诱导产生的适应性调节T细胞(iTreg)。nTreg主要在胸腺中天然产生，在高浓度IL-2通过TCR刺激，促进CD4+CD25+Foxp3+Treg活化和增殖。

nTreg可通过免疫抑制性因子IL-10和TGF-β抑制其他T细胞的活化，并通过上调IL-2受体的表达，抑制其他T细胞与IL-2的结合，抑制T细胞的增殖。nTreg表达的抑制分子CTLA-4与抗原呈递细胞表面CD80和CD86的结合，启动抑制信号。IL-2作为T细胞体外扩增最重要的细胞因子，在活化扩增T细胞的同时，调节性T细胞也会被活化并增殖，这也为后续的细胞治疗尤其是实体肿瘤的治疗带来不小的隐患。已有研究表明，调节性T细胞在肿瘤局部富集，通过免疫抑制功能使肿瘤免疫逃逸，导致机体对肿瘤的免疫无应答或免疫耐受，因此，亟需一种新型的T细胞体外扩增方法，在保证T细胞杀伤肿瘤靶细胞功能的前提下，降低调节性T细胞的比例，为后续的细胞免疫治疗扫清障碍。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种减少调节性T细胞(Treg)比例的培养方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。通过IL-7及IL-15细胞因子替代IL-2，经过14天的T细胞体外扩增培养，可得到与传统IL-2细胞因子培养方法相当的T细胞总数，且调节性T细胞的比例可控制在1％以下，不易转化，可作为良好的免疫抑制剂使用。

为解决以上技术问题，可通过以下技术方案实现：