[发明专利]一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法

说明书

本发明涉及一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，具体包括以下步骤：(1)制备生物素化的抗体；(2)纯化目标亚型外泌体；(3)免疫标记。与现有技术相比，本发明克服了目前免疫电镜技术检测外泌体时纯度低、效率低的弊端，保留了其分辨率高的优势，适合检测位于生物医学标本来源外泌体的微量抗原的检测，阳性信号得率高，便于判断。

技术领域

本发明涉及一种外泌体标记方法，尤其是涉及一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法。

背景技术

免疫电镜是生物医学领域广泛应用的技术手段，是免疫组织化学技术和电镜技术结合的产物，能够实现在超微结构水平上观察待测抗原在生物医学样品中的精确定位。胶体金标二抗标记法是现在免疫电镜技术常用的一种手段。胶体金二抗是第二抗体与直径不同的金颗粒通过静电作用形成复合物，胶体金二抗与一抗结合，再与其相应的抗原结合，在电镜下会观察到相应抗原表位的致密颗粒。

外泌体是一种由细胞主动分泌到胞外的囊泡小体，直径为30-100nm，携带有来源细胞的多种蛋白和RNA成分，可作为细胞间信息交流和物质传递的媒介。外泌体的产生是由细胞膜内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到细胞外。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，人体细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。不同细胞产生的外泌体或者不同疾病状态下产生的外泌体内含物及膜表面蛋白都不尽相同，所以外泌体具有一些特性：1、细胞来源特异性，即外泌体除了通用标志物外，还有来源细胞的特异性标志物。2、疾病状态相关性，即外泌体内部可包含特定物质，与疾病状态有关。3、外泌体研究精确度要求高，因为外泌体粒子直径小，属于纳米级别，对仪器或者研究方法要求敏感度高，对外泌体提纯的纯度要求也高。有关外泌体分泌机制、外泌体内含物组成、外泌体靶向进入特定细胞、作为“运载物”的潜力和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。对外泌体的精准研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

胶体金标记法免疫电镜是外泌体研究的非常重要的技术手段，可对外泌体进行形态鉴定，也可对外泌体所携带的特定蛋白进行胶体金标记显示。但是，既往的免疫电镜存在一些不足之处：1、纯度低，由于外泌体分离和纯化产物多是多种细胞来源的混合产物，所以在进行某种标志物染色的时候，由于混杂外泌体的干扰，目的粒子比例可能不高，视野中充满非目标外泌体干扰。2、效率低，传统胶体金免疫电镜做法步骤多，包括封闭、抗体孵育、反复洗涤、复染等二十几个步骤，用作电镜观察载体的铜网与外泌体的粘附是通过物理吸附的方式，在后续的每一步操作中都会产生外泌体脱落和损失，导致最终观察时外泌体数量稀少。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，包括以下步骤：

(1)制备生物素化的一抗：用碱性缓冲溶液将生物素化的蛋白质稀释并充分透析，得到蛋白质溶液，向蛋白质溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺生物素的二甲亚砜溶液，搅拌，然后加入NH₄Cl溶液，搅拌、透析、洗脱后收集得到的生物素化的一抗样品；

(2)纯化目标亚型外泌体：将生物样本离心分离，加入步骤(1)得到的生物素化的一抗孵育，然后与亲水性链霉素亲和磁珠混合孵育，磁分离，洗涤后再加入解离液孵育，磁分离后收集上清液，即得到纯化的目标亚型外泌体；

(3)免疫标记：将步骤(2)中得到的外泌体重悬，然后将外泌体滴于parafilm膜上，将铜网置于液滴上漂浮，然后将铜网转移至PBS和NH₄Cl液滴中处理，然后转移至一抗孵育、洗涤，然后转移至胶体金二抗，洗涤，用磷钨酸复染，干燥后，得到待检测的标记外泌体。