[发明专利]一种体内筛选的剪切RNA的锤头状核酶

权利要求书

1.一种细胞内筛选催化分子间剪切核酶的策略，其特征在于，以细胞为筛选载体，毒蛋白IbsC为报告基因，构建含有IbsC毒性蛋白基因和核酶DNA文库的质粒文库，将质粒文库转入细胞后，通过核酶对毒性蛋白mRNA的剪切作用控制毒性蛋白的表达，进而影响细胞存活，从而筛选获得活性核酶。

2.根据权利要求1所述的细胞内筛选催化分子间剪切核酶的策略，其特征在于，具有剪切活性的核酶HHRz可以剪切毒蛋白mRNA导致其表达下调，细菌可在筛选平板上形成单克隆；但无活性的核酶HHRzm不能剪切毒蛋白mRNA，毒蛋白基因超表达使得细菌死亡而不能在筛选平板上形成克隆，从而将非活性序列从中筛选剔除，仅筛选出有活性的核酶序列。

3.根据权利要求1所述的质粒文库，其特征在于，核酶与毒蛋白由不同的启动子起始表达并分别独立表达；核酶的转录表达由自身的启动子和终止子控制，核酶DNA文库构建到tRNA基因的反密码子环序列中以保证转录所得的核酶的稳定性；核酶的底物结合区域与IbsC毒性蛋白基因转录所得的部分mRNA互补，以形成核酶与IbsC毒性蛋白基因分子间剪切的模型；毒蛋白基因的表达由自身的启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子序列和终止子控制，在毒蛋白基因的N端融合表达一个额外的蛋白基因，以此提高核酶与底物的相对比例以增强核酶在体内的剪切。

4.一种具有位点特异性内切核酸酶活性的核酶，其特征在于，由第一底物结合区域、大催化活性中心、茎环结构(茎2和突环2)、小催化活性中心、第二底物结合区域组成；大催化活性中心含有7个碱基CUGAUGA(SEQ ID NO 19)，小催化活性中心含有4个碱基GAAA(SEQ IDNO 20)，茎2和突环2连接两个催化活性中心。

5.根据权利要求4所述的核酶，其特征在于，特异性识别的剪切位点位于底物的第一底物结合区域和第二底物结合区域之间，其序列规则为“NUX”，N表示随机碱基(N＝A或T或C或G)，X表示除了G以外其他三个碱基(N＝A或T或C)，并在X后发生特异剪切；“NU”与锤头状核酶序列相互作用以配对碱基的形式存在，“X”以非配对碱基形式存在。

6.根据权利要求4所述的核酶，其特征在于，该核酶具有第一底物结合区域和第二底物结合区域两个底物结合区域，位于催化核心区域的两侧；两个底物结合区域分别与预先选定的RNA底物通过碱基互补配对的方式结合，底物结合区域序列可以根据不同底物的序列而发生相应的变化；底物结合区域的长度可以变化，只需与预先选定的RNA底物序列结合形成稳定的双链结构即可。。

7.根据权利要求4所述的核酶，其特征在于，茎2通过碱基互补配对的方式形成茎结构，有3～8个碱基配对；突环2的序列长度为3～8个碱基；在优选方案中，茎2和突环2序列可以为SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28或SEQ ID NO 29所述任一序列。

8.根据权利要求4所述的核酶，其特征在于，剪切方式主要为分子间剪切。

9.根据权利要求4所述的核酶，其特征在于，适用于胞外、原核细胞内、真核细胞内针对目标底物分子的位点特异性的催化剪切，实现对选定基因的表达下调。