[发明专利]一种基于人工模拟核酸技术的增效PCR法富集DNA目标区域的方法

说明书

本发明公开了一种基于人工模拟核酸技术的增效PCR法富集DNA目标区域的技术。本发明保护由内侧引物对和外侧引物对组成的特异引物组；内侧上游引物包括区段Ⅰ和区段Ⅱ，内侧下游引物包括区段Ⅲ和区段Ⅳ；区段Ⅱ和区段Ⅳ针对某一靶序列；外侧上游引物和外侧下游引物中均具有非天然核苷酸。本发明还保护一种富集靶序列的方法：以含有靶序列的DNA为模板，采用特异引物组进行PCR扩增；PCR扩增的反应体系中具有配对脱氧核苷酸。本发明在增效PCR中的基础上，引入非天然碱基对尾巴引物设计，可以有效避免非特异扩增以及引物二聚体形成，能够极大的降低各种背景干扰，扩增效果近乎完美。本发明在大规模平行测序领域有很大的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种基于人工模拟核酸技术的增效PCR法富集DNA目标区域的方法。

背景技术

人工模拟核酸(Artificial Nucleic Acid Analogues)是指一种通过对核苷酸的修饰或改造，人工设计合成的可以行使或模拟天然核酸功能、而又具有相对独立性的人造核酸。本领域技术人员公知，核苷酸都是由碱基和糖环骨架组成，因此，针对核苷酸的修饰或改造也分为两大类：一类则是针对糖环骨架的修饰改造，如锁核酸、肽核酸是这一类的代表；另一类是针对碱基的修饰改造，例如早期的异胞嘧啶/5-甲基异胞嘧啶(isoC/isoMeC)与异鸟嘌呤(isoG)、Benner SA研究组开发的2-氨基-8-(1'-β-D-2'-脱氧核糖基)-咪唑并[1,2-α]-1,3，5-三嗪-4(8H)-酮(2-amino-8-(1'-β-D-2'-deoxyribofuranosyl)-imidazo[1,2-α]-1,3,5-triazin-4(8H)-one,dZ)与6-氨基-5-硝基-3-(1'-β-D-2'-脱氧核糖基)-2(1H)-吡啶酮(6-amino-5-nitro-3-(1'-β-D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone,dP)，Hirao I研究组开发的7-(2-噻吩基)-咪唑并[4,5-β]吡啶(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-β]pyridine，Ds)和2-硝基吡咯(2-nitropyrrole,Pn)/2-硝基-4-丙炔基-吡咯(2-nitro-4-propynylpyrrole,Px),以及Romesberg FE研究组开发的dNaM-d5SICS和dNaM-dTPT3等等，如图1所示。针对碱基的修饰改造(也就是人工模拟的非天然碱基对)的研究发展至今已有近40年的历史，这其中人工碱基对isoC-isoG以及isoMeC-isoG堪称经典。有关人工碱基对isoC-isoG的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开展的，其团队实现了含有非天然碱基对isoC-isoG的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。基于非天然碱基对与天然碱基对之间的正交性，拜耳曾将isoMeC-isoG引入到分支DNA检测(branched DNA assay)技术中用于HIV的检测，从而显著降低了背景信号的干扰，成功的将检测灵敏度提高了1000倍。客观来讲，目前最为成功的人工碱基对主要有上述提到的dZ-dP、Ds-Pn、Ds-Px、dNaM-d5SICS以及dNaM-dTPT3等等。这几对人工碱基对不仅实现了体外复制、转录还实现了体外PCR扩增，并且保真性接近天然核酸。这其中dNaM-d5SICS甚至实现了在细菌体内的高保真复制。