[发明专利]一种表达人胰岛素基因的重组乳酸乳球菌

说明书

本发明提供一种分泌表达人胰岛素和Exendin‑4的重组乳酸乳球菌MG1363。本发明构建了用于表达人胰岛素基因和Exendin‑4基因的专用重组乳酸乳球菌。培养和发酵该重组乳酸菌即可实现人胰岛素基因和Exendin‑4基因在乳酸菌表面展示表达。实验证明，本发明的重组乳酸菌能够正确的在其表面对人胰岛素基因和Exendin‑4基因进行展示表达，定位于重组乳酸菌表面的重组人胰岛素具有与天然胰岛素十分相似的空间结构，其可以与胰岛素多克隆抗体发生特异性结合，定位于重组乳酸菌表面的Exendin‑4和GLP‑1具有相同的生理功能，作用于相同的受体，还发现Exendin‑4比GLP‑1与受体的亲和性更高。

技术领域

本发明属于功能蛋白重组表达技术领域，具体涉及一种表达人胰岛素基因的重组乳酸乳球菌工程菌。

背景技术

糖尿病是由于机体内胰岛素分泌缺陷或/和胰岛素抵抗而引起的糖、脂、蛋白质代谢紊乱的一种慢性内分泌代谢疾病。糖尿病主要包括三种类型，I型糖尿病(Type Idiabetes mellitus,T1DM)、Ⅱ型糖尿病(Type II diabetes mellitus,T2DM)和妊娠糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus,GDM)。I型糖尿病是一种自身免疫性疾病，是自身的T细胞过度反应从而选择性破坏胰腺中产胰岛素的P细胞，从而导致胰岛素的绝对缺乏。I型糖尿病多见于儿童和青少年，需要靠每天注射胰岛素来控制血糖，没有胰岛素，患者将无法生存，故该病也称为胰岛素依赖性糖尿病。Ⅱ型糖尿病又称为非胰岛素依赖型糖尿病，体内的胰岛细胞破坏并不严重，仍然能够产生一定量的胰岛素，但机体对胰岛素产生抵抗，从而导致胰岛素出现相对不足，主要发病糖尿病后期会导致严重的并发症。妊娠糖尿病是在妊娠期间被诊断的糖尿病，可能会对婴儿造成一定的影响。

针对I型糖尿病，有研究表明通过给T1DM的模型非肥胖糖尿病(Non-obesediabetic，NOD)小鼠口服胰岛素能够减轻或延缓其发病过程，其机制是抗原通过黏膜Peyer’s区吸收，从而激活免疫系统，之后与耐受性相关的效应T细胞被激活，引发口服耐受性，从而保护胰岛素不被损伤。但是如果直接口服抗原，因为抗原绝大多数都是蛋白质，蛋白质在口服过程中经过胃肠环境的影响，会发生明显的降解，因此严重影响抗原的有效作用效率。因此需要一种能够达到食品级要求的运输载体来降低或减轻抗原在经过肠胃环境时所受的损伤。

GLP-1是人体内分泌的一种胰高血糖素样肽，其可以促进胰岛素基因转录和胰岛素分泌，提高受体对胰岛素的敏感性，从而达到降低血糖水平的目的。GLP-1受体(GLP-1R)广泛分布于胰岛和其他组织如心脏、肾脏、肺、胃肠道和中枢神经系统的多个区域。GLP-1的功能由GLP-1R介导，GLP-1R可通过Ga_s、Ga_q、Ga_i和Ga₀介导细胞内多条信号通路发挥生理功能，GLP-1可促进胰岛素的生物合成(从根本上解决胰岛素缺乏问题)和分泌；可抑制胰岛P细胞凋亡和促进其增殖(有助于恢复胰岛细胞的功能)；可减缓胃排空和抑制食欲从而控制患者体重；增加外周组织对胰岛素的敏感性；还具有保护心血管功能(可缓解糖尿病并发症)，因此，GLP-1成为最理想的治疗Ⅱ型糖尿病的药物，正受到空前的关注。

尽管GLP-1抗糖尿病功能众多，但由于其体内半衰期很短(1－2min)，很快会被体内广泛存在的DPP-IV降解失去生物活性，因此天然形式的GLP-1不适合用来作为抗糖尿病的临床药物。