[发明专利]DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法和表达纯化方法在审
| 申请号： | 201910025199.6 | 申请日： | 2019-01-11 |
| 公开（公告）号： | CN109576254A | 公开（公告）日： | 2019-04-05 |
| 发明（设计）人： | 邹媛华;朱梦洁;王笃强 | 申请（专利权）人： | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/90 | 分类号： | C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12Q1/533 |
| 代理公司： | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 汤东凤 |
| 地址： | 215200 江苏省苏州*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 制备 原核表达载体 位点特异性 研究和应用 特异性DNA 表达菌株 残留检测 两步纯化 天花病毒 样品活性 制备过程 重组蛋白 工程菌 核酸 构建 菌体 收率 切割 蛋白 转入 重复 | ||
1.DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法为构建DNA拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体，转入工程菌中，经培养后，获得表达菌株，然后进行表达纯化。
2.根据权利要求1所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述拓扑异构酶Ⅰ到原核表达载体使用pet30a，所述工程菌为BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述拓扑异构酶Ⅰ为重组DNA拓扑异构酶Ⅰ其氨基酸序列如SEQ ID No.3：MRALFYKDGKLFTDNNFLNPVSDNNPAYEVLQHVKIPTHLTDVVVYGQTWEEALTRLIFVGSDSKGRRQYFYGKMHVQNRNAKRDRIFVRVYNVMKRINCFINKNIKKSSTDSNYQLAVFMLMETMFFIRFGKMKYLKENETVGLLTLKNKHIEISPDKIVIKFVGKDKVSHEFVVHKSNRLYKPLLKLTDDSSPEEFLFNKLSERKVYECIKQFGIRIKDLRTYGVNYTFLYNFWTNVKSISPLPSPKKLIALTIKQTAEVVGHTPSISKRAYMATTILEMVKDKNFLDVVSKTTFDEFLSIVVDHVKSSTDGLEHHHHHH。
4.DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法，其特征在于，所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法中所述表达纯化步骤如下：
步骤1，将获得的菌种1：100接种到LB培养基中，37℃，250rmp震荡培养到OD600＝0.6时，加入1mM IPTG诱导表达，同时低温诱导表达，转离心收菌；
步骤2破菌，菌体总量与破菌缓冲液1∶10混合，超声破菌，转离心收集上清。
5.根据权利要求4所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法，其特征在于，所述破菌缓冲液为50mM Tis-Hcl，500mM NaCl混合溶液pH8.0。
6.根据权利要求5所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法，其特征在于，所述纯化的方法为镍柱纯化。
7.根据权利要求6所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法，其特征在于，所述纯化步骤如下：
步骤3.1第一步平衡：用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，10mM咪唑)平衡柱子，缓冲液及样品中不可有EDTA，Arg等物质，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5～10个柱体积，检测调零后可以上样；
步骤3.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出；
步骤3.3第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；
步骤3.4第四步预洗：用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，50mM咪唑)预洗，收集洗脱组分；
步骤3.5第五步洗脱：用洗脱液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，200mM咪唑)洗脱目标蛋白，收集洗脱组分；
步骤3.6第六步洗柱：用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，500mM咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分。
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