[发明专利]一种解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体

说明书

本发明公开了一种解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体。杆状病毒表达系统不具有显著的剂量效应，即高病毒滴度并不能提高外源基因的产量。其原因是高滴度诱导了晚期表达因子LEF‑10的聚集，进而抑制了晚期基因的表达。该载体通过突变LEF‑10第21位亮氨酸位点，使LEF‑10聚集倾向性降低。用高滴度突变型杆状病毒感染昆虫细胞，可以显著提高晚期启动子控制的外源基因的表达量。表达产量的提高能显著降低企业的生产成本。该杆状病毒表达载体可用于生物制品工业领域，特别是亚单位疫苗工业领域。

技术领域

本发明属于重组蛋白质表达技术领域，尤其涉及一种解除高滴度抑制的杆状病毒表达载体。

背景技术

杆状病毒是特异感染节肢动物的双链DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）是杆状病毒的模式种。自从1983年Smith GE等首次用杆状病毒在昆虫细胞中表达人β-干扰素基因以来（Mol CellBiol. 1983; 3:2156-65），由于具有低成本、高产量，而且具备各种翻译后修饰系统等优点，杆状病毒表达载体系统在科研和生产中被广泛应用。

在蛋白质表达领域，人们公认基因表达具有剂量效应的，即基因的拷贝数和蛋白的表达量有一定的正相关性，但是杆状病毒表达系统是个特例。在很久以前研究人员就发现，感染昆虫细胞时，随着病毒滴度的提高，外源蛋白的表达量并没有明显提高；在更高的滴度下蛋白的产量反而下降了（Biotechnol Bioeng. 1994; 44:710-719）。

杆状病毒表达系统是个瞬时表达系统，在工业使用上，人们希望在一个生产批次上获得更多的蛋白，但由于高滴度病毒对产量并无益处，所以生产上通常使用MOI 3-5感染细胞，而无法通过增加MOI提高蛋白产量。

LEF-10是杆状病毒必需的晚期表达因子（Virus Res. 2013; 175:45-51, PLoSOne. 2016; 11:e0154835），其具体的生理功能目前尚不清楚。先前的研究发现，LEF-10具有强烈的聚集倾向（Virus Genes. 2004; 29:191-197）。在杆状病毒感染的昆虫细胞中发现，高滴度病毒可以诱导LEF-10形成聚集体，而聚集体一旦形成，晚期启动子控制的外源基因几乎不表达（PLoS One. 2016; 11:e0154835）。这一发现暗示了这样一种可能：即杆状病毒表达系统不具有基因剂量效应的原因，是因为高病毒滴度诱导了LEF-10聚集，进而阻断了晚期启动子的表达。

如果能解除LEF-10聚集导致的抑制作用，工业生产上就可以通过高滴度病毒感染，提高外源蛋白的产量，但到目前为止，还没有降低LEF-10聚集倾向性的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种解除高滴度抑制的杆状病毒载体，旨在解决背景技术提及的杆状病毒表达系统不具有基因剂量效应的问题。

本发明通过突变LEF-10第21位亮氨酸残基，获得了LEF-10聚集倾向性下降的杆状病毒表达载体。用该表达载体，可以实现通过高MOI提高外源蛋白产量的目的。

本发明中LEF-10第21位亮氨酸残基可以被替换为丙氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、赖氨酸、酪氨酸等氨基酸残基。用这些氨基酸替换亮氨酸后，都能不同程度降低LEF-10聚集倾向。