[发明专利]一种基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的引物及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的引物及检测方法，包括以下步骤：以待测植物或土壤样本的基因组DNA为模板，由引物一和引物二连接高通量测序通用引物接头后进行PCR扩增，PCR扩增产物纯化后进行高通量测序，将测得的原始序列经过处理得到Cleandata序列，与具有明确注释信息的丛枝菌根真菌28SrRNA参照序列相应的区域进行Blast比对，通过设置比对的相似度和覆盖率，筛选出与参照序列具有较高相似度的序列等；本方法可以灵敏地检测出土壤样本中的丛枝菌根真菌孢子和植物中的丛枝菌根真菌菌丝体，并可以使丛枝菌根真菌在属的水平上得到更好的注释，既可以进行定性分析也可以进行相对定量分析。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中鉴定植物或土壤样本中丛枝菌根真菌的方法及专用引物，具体设计一种基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的引物及检测方法。

背景技术

丛枝菌根真菌可与绝大多数维管束植物根系形成互惠共生体“菌根”。寄主植物通过丛枝菌根真菌吸收矿质营养，而丛枝菌根真菌从植物获得光合作用产物。由于菌根可促进多种植物生长和发育，提高植物抵御不良环境的能力，提升植物的竞争力，是一种很有前景的生物肥料。丛枝菌根真菌是一类专性活体营养共生菌，即只有与活体植物根系建立共生体系后才能正常地生长、发育、繁殖并完成其生活史。丛枝菌根真菌的孢子存在于土壤中。丛枝菌根真菌的孢子是丛枝菌根真菌鉴定的重要依据，但存在着分离过程繁琐，鉴定难度高，需要专门技术人员进行鉴定等特点。分子鉴定技术是进行丛枝菌根真菌鉴定的另一种手段，具有精确性高的特点。随着高通量测序技术的发展，利用高通量测序技术进行丛枝菌根真菌多态性的研究也在进行中，基于高通量测序技术平台Illumina，300bp左右成为主流的测序长度，使得有必要开发一种适宜于目前300bp左右长度测序技术的引物序列及鉴别方法。目前的Illumina平台测序方法多集中于研究ITS2区域，但由于扩增ITS2区域的引物并非专门为丛枝菌根真菌设计，使得丛枝菌根真菌的检测效果并不理想。另外，丛枝菌根真菌的28SrRNA区域相较于ITS区域有着更好的系统发育关系，有必要基于28SrRNA区域设计一种针对丛枝菌根真菌的引物对及比对方法，在目前生物信息学方法中，多使用Cleandata与数据库直接进行对比，这样比对的结果相似度最高的往往为未详细注释的序列，而忽略掉有明确注释的序列，例如数据库中有明确注释的序列，也有显示“未知”序列，而大部分情形，检测到的序列在数据库进行对比，相似度最高的序列都注释为“未知”，根本无法查询所获序列的详细分类信息；所以有必要建立一种以有明确注释信息序列为对比序列的方法，提高样本中丛枝菌根真菌的检出率以及注释准确度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的引物及检测方法，所使用的方法直接分析生物基因型而非表现型，所以鉴定结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响。该方法不仅可以弥补丛枝菌根真菌的孢子形态鉴别中的主观因素，同时具有用量少、效率高、稳定性高、准确可靠的特点；同时，能够避免在数据库中比对时，得到的是注释为“未知”的序列，而无法获得明确注释的序列信息。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的引物及检测方法，其特征在于，丛枝菌根真菌的引物有两条，分别为:

引物一：5’-CCGCTGAACTTAAGCATATC-3’；

引物二：5’-AGCTGCAWTCCCAAACAACT-3’；

其中引物二中的W为简并引物，该位点A和T等比例混合，比例为1：1；

基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的检测方法，包括以下步骤：