[发明专利]一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法

说明书

本发明属于基因工程领域，具体为一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法。本发明首先构建双质粒系统：敲除质粒(KO质粒)编码用于敲除必需基因的Cas9和sgRNA，营救质粒(Rescue质粒)编码由Tet‑off系统调控的外源补偿基因，然后将两个质粒同时转入细胞后用药筛若干天，分选单克隆，通过测序鉴定，获得必需基因纯合敲除细胞系。本发明中可以通过加Doxcyclin关闭外源基因表达，以研究必需基因的功能。另外，本发明中Rescue质粒可以被另外一个含有不同抗性基因的Rescue2质粒替换，Rescue2质粒上编码必需基因的突变体，用以研究必需基因突变体的功能。本方法操作简单，实验周期短。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法。

背景技术

在细胞中敲除靶基因并观察所得表型是生物学研究中确定一个基因功能最常用的方法。然而，有一些基因是维持细胞存活必不可少的，称为必需基因。直接敲除必需基因，将导致细胞死亡，无法研究敲除后对细胞功能的影响。这类基因只能靠条件性敲除研究。

已有的几种条件性敲除方法总结如下：

1)Cre/loxP重组系统是条件性敲除必需基因最常用的方法。该技术需要在靶基因两侧插入一对34bp的loxp位点，在Cre重组酶作用下，两个lox位点之间的序列会发生重组删除。所用的Cre重组酶一般为mer-cre-mer，加雌激素Cre可以发挥重组功能。Cre需要整合到基因组上表达。

2)另一种常用的方法是利用Tet-On/Tet-Off调控基因表达。首先构建一个稳定表达转录激活因子tTA的细胞系，然后将TRE启动子插入到内源基因上游启动子序列中，这样就可以调控内源基因表达。也可以先引入外源基因，再将内源基因敲除，外源基因启动子为TRE启动子，受Dox调控表达。然而这些方法都需要多个步骤来构建外源基因稳定整合的细胞系，耗时耗力。研究突变对基因功能的影响时，往往需要将突变引入到内源基因上，工作量很大。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法及研究必需基因突变体功能的方法。本发明方法简单、快速、有效。本发明通过构建同时存在条件下细胞才能存活的一个双质粒系统，把CRISPR/Cas9基因编辑系统、Tet-Off诱导调控系统和外源基因克隆到这个双质粒系统中，实现必需基因条件性敲除。本发明的技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法，具体步骤如下：

(1)构建双质粒系统，双质粒系统包含KO质粒(敲除质粒)和Rescue质粒(营救质粒)，KO质粒含有用于敲除内源基因的sgRNA和Cas9基因，用于调控外源基因表达的tTA基因和负责质粒在真核细胞中复制的EBNA1和oriP元件；Rescue质粒含有补偿敲除的必需基因的外源补偿基因，用于筛选转染成功细胞的抗药基因和在EBNA1蛋白的作用下可以使质粒在真核细胞中复制的oriP元件；将靶向目的基因的sgRNA克隆到KO质粒上，将外源补偿基因cDNA克隆到Rescue质粒上；

(2)将双质粒系统转染到细胞中，在药物筛选下培养若干天，分选单克隆，测序鉴定，即筛选出必需基因纯合敲除的细胞系。

本发明中，步骤(1)中，为了避免Rescue质粒上的外源基因被KO质粒上的CRISPR/Cas9靶向破坏，需要在Rescue质粒的sgRNA靶向序列和PAM序列上引入同义突变。

本发明中，Rescue质粒中的外源补偿基因表达受Dox诱导调控。

本发明中，步骤(1)中，Rescue质粒还含有荧光素基因，方便观察转染效率和Tet-Off调控效果。

本发明中，步骤(1)中，Rescue质粒中含有的抗药基因是puromycin抗性基因、zencin抗性基因、Blast抗性基因或neomycin抗性基因中任一种。