[发明专利]一种含有牡丹干细胞活性物的培养提纯方法及应用

权利要求书

1.一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，包括以下的步骤：

（1）外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，用毛笔蘸药皂水刷洗表面灰尘，然后用流水冲洗0.5～1h，在超净工作台上先用体积浓度为50～80%的乙醇充分振荡15～60s，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2%次氯酸钠溶液充分振荡灭菌8～15min，最后用无菌水冲洗4次备用；

（2）切片：灭菌后的植株将花、叶片、茎段和根分开；花、叶片切成lcm×1cm大小，将花蕊、茎、根横切成0.9～1.1mm的薄片；

（3）愈伤组织培养：取步骤（2）中的切片放入基本培养基，加入糖类，培养；

（4）细胞悬浮液培养：选取步骤（3）中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料，以料液比1:7～20的比例加入液体培养基和外源植物激素，并加入糖含量为15～45g/L的糖类，调pH6～7，放置在转速为60～120rpm/min摇床上，在25℃黑暗状态下，振荡培养15～35天，得悬浮细胞；

其中，外源植物激素为1.0～3.0mg/L 6～苄基腺嘌呤(6～BA )，1.0～3.0mg/L蔡乙酸(NAA)，0.5～1.5mg/L 2，4一二硝基苯氧乙酸(2，4～D)中的至少一种；

（5）真空抽滤步骤（4）悬浮细胞，减压浓缩，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅰ；

（6）超声提取：真空抽滤步骤（4）悬浮细胞，加入酸性醇溶液，置于超声波合成萃取仪中提取，抽滤，在残渣中加入醇溶液，继续提取；两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；

（7）减压浓缩至无醇，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅱ。

2.如权利要求1所述的一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，其特征在于，（6）超声提取：将步骤（4）悬浮细胞真空抽滤后，以料液比为1：6～18加入体积分数为40～95%的酸性乙醇溶液，该乙醇溶液中含体积分数为0.1%的无机酸，然后置于超声波合成萃取仪中超声波提取，提取温度为35～60℃，提取时间为10～60 min；超声频率为20～40 kHz，抽滤，在残渣中加入乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液。

3.如权利要求1所述的一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，其特征在于，（7）中，干燥方式为真空冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干中的任一种。