[发明专利]一种基于生物素量子点探针的C反应蛋白超敏检测方法

权利要求书

1.一种基于生物素量子点探针的C反应蛋白超敏检测试剂盒，其特征在于，所述C反应蛋白(C-reactive protein，以下简称CRP)，包括以下检测步骤：

步骤一、分别在盛有包被好抗-CRP固相单抗的膜芯片基底的西林瓶中，各自加入2mL含有10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL的C反应蛋白溶液，37℃孵育1h后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍；

步骤二、分别加入2mL含有0.01mg/mL链霉亲和素和抗CRP单抗耦合的QDs探针受体蛋白的PBS溶液，37℃孵育30min后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍；

步骤三、加入2mL 1:2000倍稀释的生物素化荧光QDs，37℃下孵育20min后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍，氮气快速吹干纤维素基底膜后用紫外——可见光分光光度计测量其荧光强度；

所述步骤二所述链霉亲和素和抗CRP单抗耦合的QDs探针受体蛋白的制备方法为：

(1)、将80μg CRP单抗溶解于100μL超纯水中，超声溶解5min，严格控制水浴温度不能超过40℃；

(2)、加入150μL 0.1M新鲜配制的过碘酸钠溶液，室温下避光反应30min；

(3)、反应结束后将反应溶液装入截留分子量为10kDa的透析袋中，于1mM,pH＝4.5的醋酸钠溶液中4℃下透析过夜；

(4)、透析结束后加入0.2M pH＝9.5的碳酸钠缓冲液2μL，调节溶液的pH到9.5，之后立即加入20μL溶解有150μg链霉亲和素的0.1M碳酸缓冲液中，室温下避光轻微搅拌2.5小时；

(5)、反应结束后快速加入100μL新鲜配制的4.5mg/mL硼氢化钠，充分混合均匀，在4℃轻微搅拌反应2小时，还原抗体分子表面过多氧化的糖基；

(6)、反应结束后将上述产物置于透析袋中，在0.15M，PH＝7.4的PBS缓冲液中4℃下透析24小时，每8小时更换一次透析液；

(7)、将透析后的产物置于截留分子量为100kD的浓缩离心管中，于3000rpm下离心30min，除去未反应的蛋白；

(8)、浓缩离心后的产物利用G25 Sephadex琼脂葡聚糖凝胶分子筛层析柱纯化分离，测定浓度后于4℃保存待用，于此制备出链霉亲和素和抗CRP单抗耦合的生物素QDs荧光探针受体蛋白；

步骤三所述的生物素化荧光QDs探针的制备方法为：

(1)、取300μL浓度为10mg/mL水溶性QDs于离心管中，加入900μL 0.1M pH＝4.7MES后超声分散5min，混合后体积为1200μL；

(2)、分别加入2.2mM EDC和4.5mM NHS，37℃下避光反应40min；

(3)、29000rpm下冷冻高速离心30min后弃上清，用0.01M pH＝7.4的PBS溶液冲洗后将量子点分散于该溶液中重复离心后将沉淀再次分散于上述PBS溶液中；

(4)、于溶液中加入0.78mg/mL生物素乙二胺PBS溶液，在37℃下避光反应3h；

(5)、用含1.5％BSA的PBS溶液封闭45min后于30000rpm冷冻高速下离心30min弃上清；

(6)、将得到的沉淀再次分散于0.01M pH＝7.4的PBS溶液中4℃保存待用，于此制备出生物素化荧光QDs探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，步骤一所述CRP固相抗体的膜芯片基底的制备方法：

将表面羧基化处理的纤维素滤膜片放置于西林瓶中，加入浓度为0.15mol/L、pH＝4.7的MES缓冲溶液1000μl，分别加入2.5mmol EDC和4.5mmol Sulfo-NHS在20℃下反应45min，之后将膜片取出，用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗干净膜片表面残留的反应液，将之放置于浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的1000μl PBS缓冲溶液中，同时加入CRP固定抗体，使溶液中抗体的终浓度为20μg/ml，20℃～25℃下避光反应3.5h，反应结束后取出滤膜，用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液再次将膜片表面残留的反应液冲洗干净后加入1％BSA溶液于37℃孵育封闭40min，之后将膜片用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗三遍后待检测用，于此制备出固定有CRP捕获抗体的膜芯片基底。