[发明专利]联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于医药生物领域，具体涉及联合MSLN单链抗体和PD‑1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。该CAR载体包括MSLN单链抗体和PD‑1mAb，CAR结构为CD8leader‑MSLN scfv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ‑IRES‑PD‑1mAb，以病毒感染方式获得CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，靶向识别和杀伤MSLN阳性表达的胃癌细胞。PD‑1mAb与T细胞表面的PD‑1结合，阻断PD‑1和PD‑L1的结合，从而上调T细胞的生长和增殖，使CAR‑T细胞表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。

背景技术

胃癌是我国目前临床比较常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和高死亡率的特点，在我国，胃癌的发病率和死亡率占恶性肿瘤的第三位。目前，胃癌的治疗方式主要有手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗。手术是唯一可能治愈胃癌的方式，但进展期胃癌的单纯手术治疗可能会存在肉眼或镜下残留灶，使复发转移率大大增加；放化疗毒副作用大，疗效也不能达到满意效果；因此新的治疗方法亟待提出。

LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段，但是以上各种治疗方法均缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力；而肿瘤免疫编辑的过程又会使靶细胞表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)在肿瘤细胞表面表达下降，形成免疫逃逸，使肿瘤细胞可成功躲避T细胞攻击。

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受MHC的限制。

间皮素(MSLN)是一种存在于细胞表面的锚定糖蛋白，因其在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，但在30％的肿瘤中高表达，如卵巢癌、胃癌、结肠癌等实体瘤，而成为备受关注的肿瘤细胞特异性靶向抗原。

PD-1(Programmed cell death protein 1)程序性细胞死亡受体1，是属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，在T细胞和前B细胞上表达。通过下调免疫系统并促进自身耐受在调节免疫系统对人体细胞的应答方面起作用，预防自身免疫性疾病。PD-L1(programmed death ligand 1)是PD-1的配体，与T细胞上的PD-1结合后，可抑制T细胞增殖和活化，使T细胞处于失活状态。研究发现，多种肿瘤细胞中PD-L1均有上调表达，因此促进了肿瘤免疫逃逸。PD-1单克隆抗体(PD-1mAb)可与T细胞表面的PD-1结合，阻断PD-1和PD-L1的结合，从而上调T细胞的生长和增殖，增强T细胞对肿瘤细胞的识别，激活其攻击和杀伤功能，通过调动人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。

发明内容

本发明目的是为了解决上述问题，本发明提供了能靶向MSLN并联合PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体。本发明针对胃癌细胞特异性蛋白MSLN，有效避免肿瘤免疫逃逸；通过PD-1mAb阻断PD-1和PD-L1的结合，从而提高CAR-T免疫疗法抗胃癌的效果。此外，还包括联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法及其应用。

本发明提供的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体具体技术方案如下：