[发明专利]一种重组腺病毒、制备方法、应用

说明书

本发明公开了一种重组腺病毒、制备方法、应用，将TMEM88基因克隆入腺病毒穿梭质粒的克隆区，构建表达TMEM88的重组穿梭质粒，将该重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转化宿主细胞，经同源重组生成重组腺病毒质粒，再经包装细胞包装获得具有感染活力的腺病毒颗粒，并在包装细胞中进行扩增，收集并裂解包装细胞后，纯化得到重组腺病毒。本发明以腺病毒为载体，安全可靠，其不会与宿主染色体DNA结合，不引发癌变的风险，重组腺病毒对肝纤维化有显著效果，一次注射即可观察到逆转效果。给药方便：给药途径；采用尾静脉注射的方式给大鼠导入重组腺病毒。为肝纤维化的逆转争取了最佳时间。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域和药理学领域，尤其涉及的是一种重组腺病毒、制备方法、应用。

背景技术

肝纤维化是诸多慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段，是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外间质成分过度异常地沉积，并影响肝脏的功能。肝纤维化时，肝脏内形成纤维间隔，会破坏正常的肝内微循环，使肝内血管网减少，阻碍血流与肝细胞的直接接触，影响血液和肝细胞的物质交换，导致因炎症受损的肝细胞不易修复甚至加重损伤，正常的肝细胞缺氧、变性、坏死，使肝纤维化得以进一步的发展，形成恶性循环。此外，肝纤维化还会阻碍肝血流进入肝静脉，可助长和加剧门静脉高压的形成。若没有得到有效治疗，很可能发展成肝硬化、肝癌。我国是肝病高发国家，据估计，我国每年发生肝硬化的人数达100余万人，发生肝癌人数约40万，死亡37万，所以，肝纤维化已经严重危害到了人们的健康。

肝纤维化形成过程与血清生化有关，大致可分为慢性肝损害，细胞因子网络失调和细胞外间质代谢异常3个环节。慢性肝损害主要是致病因子持续作用造成的，例如乙肝病毒、丙肝病毒、四氯化碳等。而细胞因子之间相互作用会参与肝纤维化的调节，某些细胞因子表达低下，会引起贮脂细胞的激活，转化成为肌纤维样细胞，促进细胞外间质的合成、分泌和沉积的增加，降解减少，也会导致纤维化的形成。细胞凋亡是机体清除不必要细胞的重要途径，维持正常组织器官的生理功能。生理条件下，细胞凋亡是由基因严格控制的，然而，病理状况下，细胞增殖与细胞死亡之间的平衡被破坏，引起多种肝脏疾病的发生。现有的研究表明，在肝细胞性肝癌中，肝细胞凋亡减少。因此，可以通过调节细胞凋亡来治疗肝纤维化。

研究证实，肝星状细胞是肝纤维化形成过程中细胞外基质的主要合成分泌细胞，肝星状细胞的活化是肝纤维化发生、发展的中心事件，而Tmem88在肝纤维化小鼠原代肝星状细胞中的表达下降。

TMEM88是跨膜蛋白家族(Transmembrane protein，TMEM)成员，在爪蟾属的胚胎细胞中定位于细胞膜上，人类组织的基因芯片结果也显示，TMEM88蛋白在胎盘中表达量最高，且广泛分布于胚胎、肌肉、脾脏、心脏、肾脏，骨骼等组织中。目前研究结果显示TMEM88蛋白在肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌组织中的表达显著高于正常组织和癌旁组织。TMEM88蛋白可以调节肿瘤细胞增殖、迁徙、侵袭等，临床统计数据显示其与肿瘤的发生、发展及预后关系密切。人类的TMEM88蛋白包括两种亚型，即CRA-a和CRA-b，CRA-a即通常称之为TMEM88，能够抑制经典的Wnt通路，Tmem88在肝星状细胞活化、增殖和凋亡发挥重要作用，对肝纤维化可能具有一定的保护作用。其潜在的作用机制可能是抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制肝纤维化的进展及逆转肝纤维化过程。

近来，通过基因治疗手段来预防和治疗肝损伤成为人们研究的新方向。一些重组腺病毒如Ad-HGF-hIL10的治疗方法也证明有效。

腺病毒载体具有安全有效，携带外源基因容量大，不与宿主染色体DNA结合，容易制备和分离纯化等优点，目前在基因治疗领域中广泛应用的一种载体系统，因为其可以感染非分裂的细胞，这就为在体外、体内的实验提供了基础和保障。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：能够实现将TMEM88包装于腺病毒载体中，提供了一种重组腺病毒、制备方法、应用。