[发明专利]大规模生产符合GMP规范的临床级外泌体

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了大规模生产符合GMP规范的临床级外泌体，该方法包括以下步骤：S1：获取细胞沉淀，首先抽取病人膝关节积液，离心获得细胞沉淀，留取备用；S2：培养间充质干细胞，在符合GMP的要求下利用无血清培养基对人关节来源的间充质干细胞进行培养，留取备用；S3：生物反应器的预处理；S4：接种培养间充质干细胞；S5：培养获得外泌体。该发明所制备的外泌体具有较好的稳定性、生物相容性、生物稳定性，且制作步骤简单，降低了相应的生产成本，可大规模进行生产，直接提取细胞沉淀中的间充质干细胞，然后进行培养，培养完成后将上清液高速离心后即可获得所需的外泌体，适合推广。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体为大规模生产符合GMP规范的临床级外泌体。

背景技术

GMP是一套适用于制药、食品等行业的强制性标准，要求企业从原料、人员、设施设备、生产过程、包装运输、质量控制等方面按国家有关法规达到卫生质量要求，形成一套可操作的作业规范帮助企业改善企业卫生环境，及时发现生产过程中存在的问题，加以改善，简要的说，GMP要求制药、食品等生产企业应具备良好的生产设备，合理的生产过程，完善的质量管理和严格的检测系统，确保最终产品质量(包括食品安全卫生等)符合法规要求。

GMP级关节液间充质干细胞源性外泌体是用于医疗治疗中较好的外泌体，但它在实际制作的过程中仍存在以下弊端：

现有技术中，GMP级关节液间充质干细胞源性外泌体在生产的过程中存在稳定性较差，生物相容性较差，生物稳定性较差等现象；

且现有技术中，GMP级关节液间充质干细胞源性外泌体在生产时较为不便，生产步骤复杂，生产成本较高，不适合推广。

为此，提出了大规模生产符合GMP规范的临床级外泌体以解决上述弊端。

发明内容

本发明的目的在于提供大规模生产符合GMP规范的临床级外泌体，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：大规模生产符合GMP规范的临床级外泌体，该方法包括以下步骤：

S1：获取细胞沉淀，首先抽取病人膝关节积液，离心获得细胞沉淀，留取备用；

S2：培养间充质干细胞，在符合GMP的要求下利用无血清培养基对人关节来源的间充质干细胞进行培养，留取备用；

S3：生物反应器的预处理，将生物反应器清洗干净，然后风干，留取备用；

S4：接种培养间充质干细胞，将人关节液来源的间充质干细胞接种到微载体上，进行三维(3D)细胞培养，生物反应器的外部培养瓶不间断地提供细胞养分，细胞通过分子量截留膜和微载体保留于细胞生物反应室中；

S5：培养获得外泌体，对S4中得到的上清液进行差异超速离心分离获取外泌体，并进行洗涤步骤从培养上清液中富集纯净的外泌体。

优选的，所述步骤S2中，无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。

优选的，所述步骤S3中，生物反应器使用升降机型反应器，是指利用自然存在的微生物或具有特殊降解能力的微生物接种至液相或固相的反应系统。

优选的，所述步骤S5中，对S4中得到的上清液进行差异超速离心处理所使用的是离心机。

优选的，所述离心机的类型分为：过滤式离心机、沉降式离心机，在此所使用的是沉降式离心机。

优选的，所述步骤S2中，间充质干细胞从细胞沉淀中提取。

优选的，所述步骤S3中，生物反应器清洗10-15分钟即可。