[发明专利]一种采用TLR7激动剂刺激的自体外周血淋巴细胞的培养方法

说明书

本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别涉及一种采用TLR7激动剂刺激的自体外周血淋巴细胞的培养方法，包括如下步骤：用单个核细胞分离管和Percoll分层液从成人外周血中分离出单个核细胞和自体血清，将单个核细胞在外周血淋巴细胞培养基上进行体外培养；对体外培养的单个核细胞分瓶，1号培养瓶用OKT3抗体、OKT28抗体及细胞因子活化剌激，2号培养瓶中加入自体肿瘤抗原、细胞因子和TLR7激动剂培养后，然后合瓶培养，能有效地提高特异性效应细胞群活化效率和扩增效率。本发明充分运用自体肿瘤抗原和过程产物自体血清，对自体肿瘤细胞的杀伤更有针对性，以蠕动泵补充培养基为淋巴细胞扩增创造最优条件，所获得的淋巴细胞亚群具有特异性高杀伤肿瘤细胞的能力。

技术领域

本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别涉及一种采用TLR7激动剂刺 激的自体外周血淋巴细胞的培养方法。

背景技术

外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocyte)简称PBL，主要是血液循环中的淋巴细胞，由T细胞和B细胞组成；淋巴组织中的淋巴细胞具有下列重要特性： ①特异性：淋巴细胞表面有抗原受体，用以识别抗原；不同淋巴细胞的抗原变 体是不同的，每一受体只能与相应的抗原相结合，这就是特异性；抗原受体类 型约有100万种，全身的淋巴细胞总合起来就能识别各种抗原；②转化性：正 常体内大多数淋巴细胞均处于静止状态；只有当某种淋巴细胞受到相应抗原刺 激后才被激活，这个过程称为转化性，一般需经过40小时，淋巴细胞形态上发 生了明显变化，由一个直径5～7μm的小淋巴细胞转变为一个20～30μm的大淋 巴细胞；细胞的代谢增强，形态明显变化，核增大，染色质变细，核仁明显， 胞体内核糖体增多，胞质染色呈较强的嗜碱性；淋巴细胞转化后，进行分裂增 生，其中大部分可形成参与免疫应答的效应细胞，如能破坏靶细胞的T效应细 胞，或能分泌抗体的浆细胞；这些细胞代谢活跃，能产生免疫效应，但寿命短 (约数天或数周)；③记忆：淋巴细胞经抗原激活转化后，分裂增殖形成的细 胞中，有一部分再度转化为静息状态的淋巴细胞，称为记忆性(T或B)淋巴细 胞，其寿命长，可达数年或终生存在，它们在遇到相应抗原刺激后，能迅速转化为效应细胞，及时清除抗原，使机体免于发病；淋巴细胞这些特性，保持了 淋巴细胞正常形态和生理的动态活动。

现有公开专利：CN102816735B提供了一种采用TLR7激动剂刺激的自体外 周血淋巴细胞的培养方法,是通过向无血清培养基中添加多种抗体及细胞因子， 使效应细胞群活化；但其操作过程复杂，周期长、准确性差，淋巴细胞扩增效 率及活性不高。CN104357394A提供了一种自体外周血淋巴细胞DC-CIK的培养 方法，体外加载CTLA4抗体、PD-1抗体以覆盖所有CIK细胞表面的CTLA4、 PD-1分子,使其不能和DC上相应受体结合，降低T调节细胞的含量，但忽视 了肿瘤细胞的特异性，外源无血清培养基及抗体用量多，成本高，而且可能出现拮抗效应，以及杂菌等因素影响，会降低淋巴细胞扩增效率及活性，进而影 响肿瘤细胞杀伤效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用TLR7激动剂刺激的自体外周血淋巴细胞 的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

基本术语：

GM-CSF：巨噬细胞集落刺激因子

IL-2:：白细胞介素2

IL-1a：白细胞介素1a

IL-4：白细胞介素4

IL-1β：白细胞介素1β

PGE2：前列腺素E2

TNF-α：肿瘤坏死因子-α

CIK细胞：多种细胞因子诱导的杀伤细胞

DC细胞：树突状细胞 一种采用TLR7激动剂刺激的自体外周血淋巴细胞的培养方法，包括如下步骤：