[发明专利]去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒及其制备和应用

权利要求书

1.去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，对天坛株溶瘤痘苗病毒进行重组改造，去除TK基因，其中TK基因的核苷酸序列如序列表1所示。

2.根据权利要求1所述的去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，在减毒天坛株溶瘤痘苗病毒插入EGFP绿色荧光蛋白基因和Luciferase报告基因，所述EGFP绿色荧光蛋白基因和Luciferase报告基因由启动子P7.5控制表达，所述EGFP绿色荧光蛋白基因和Luciferase报告基因位于减毒天坛株溶瘤痘苗病毒的TK区，所述EGFP绿色荧光蛋白基因和Luciferase报告基因的碱基序列如序列表2所示。

3.根据权利要求1所述的去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，所述重组天坛株溶瘤痘苗病毒的出发病毒是天坛株。

4.去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：

步骤1，将野生型VTT病毒与针对VTT病毒TK基因的打靶质粒在细胞内重组，得到病毒；

步骤2，筛选重组纯化病毒悬液得到减毒天坛株溶瘤痘苗病毒。

5.根据权利要求4所述的去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征在于，所述针对VTT病毒TK基因的打靶质粒为pMV-VTTTK-ELuc质粒，所述pMV-VTTTK-ELuc质粒插入有痘苗病毒天坛株TK基因的上游同源重组臂VTT-TKL和下游同源重组臂VTT-TKR，所述上游同源重组臂VTT-TKL和下游同源重组臂VTT-TKR间插入EGFP绿色荧光蛋白标记基因和Luciferase报告基因，所述EGFP绿色荧光蛋白标记基因和Luciferase报告基因均由痘苗病毒启动子P7.5启动表达。

6.根据权利要求4所述的去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体按照下述步骤进行：

步骤1.1，以T25培养瓶培养CV-1单层细胞至80％覆盖；

步骤1.2，取野生型VTT病毒以0.05MOI感染CV-1细胞，并在37℃的温度下培养2小时，得到感染VTT的CV-1细胞；

步骤1.3，去除上清液，将针对VTT病毒VGF基因的打靶质粒转染至感染VTT的CV-1细胞中，在37℃的温度下培养4小时，之后更换一次新鲜培养基；

步骤1.4，将步骤1.3得到的CV-1细胞在培养箱继续培养48小时后，收集CV-1细胞，反复冻融三次，进行超声破碎，获得病毒悬液，并将其保存于-80℃的温度下。

7.根据权利要求4所述的去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体按照下述步骤进行：

步骤2.1，用6孔板培养HuTK^-143B单层细胞至80％覆盖；

步骤2.2，取步骤1得到的病毒悬液，做10倍倍比稀释，取10^-1，10^-2，10^-3稀释度的病毒悬液感染HuTK^-143B细胞，在37培养2小时；

步骤2.3，在步骤2.2处理后的6孔板的每孔覆盖2ml含50ug/ml BrdU的琼脂MEM培养基，培养3天；

步骤2.4，将经过步骤2.3处理后的6孔板在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，挑取孤立的有绿色荧光的病毒噬斑进行连续单斑纯化，约经6次纯化即可获得重组天坛株溶瘤痘苗病毒。

8.去除TK基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒作为疫苗、生物载体和抗肿瘤药物的应用。