[发明专利]一种细胞重编程方法

权利要求书

1.一种细胞重编程方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤，

第一步，超疏水微孔阵列芯片上细胞重编程；

步骤1.1：超疏水微孔阵列芯片消毒；

步骤1.2：去除微孔中的气体；

步骤1.3：细胞复苏培养；

步骤1.4：细胞重编程，具体步骤包括：

首先在超疏水微孔阵列芯片外，将重编程基因导入细胞内；再将所述细胞接种到超疏水微孔阵列芯片上，在超疏水微孔阵列芯片上完成重编程过程；超疏水微孔阵列芯片上重编程采用的培养基与常规6孔板重编程一致，并根据细胞类型选取相应的培养基成分；

第二步，超疏水微孔阵列芯片上克隆挑取；

第三步，超疏水微孔阵列芯片上微环境的优化。

2.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：步骤1.1所述的超疏水微孔阵列芯片消毒，具体为，

向固定了超疏水微孔阵列芯片的培养皿中加入12mL的75％乙醇，浸没整张疏水微孔阵列芯片，再用1mL移液枪用力吹打超疏水微孔阵列芯片的微孔，使得微孔内残余的气泡被清除，保证对整个超疏水微孔阵列芯片彻底的消毒灭菌；灭菌15min后，将75％乙醇抽走，放在超净台中风干、紫外灭菌2h以上，同时超疏水微阵列芯片恢复至疏水状态。

3.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：步骤1.2具体为，

10mL移液管吸取10mL PBS溶液，悬于超疏水微孔阵列芯片的微孔上方10cm处，逐滴滴下，并在超疏水微阵列芯片上逐片砸下，使得所有微孔中均有液体进入，并将整张超疏水微孔阵列芯片浸没。

4.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：当步骤1.4所述的细胞重编程为Dox诱导的小鼠成纤维细胞重编程，采用携带Dox诱导表达的Oct4，Sox2，Klf4和C-Myc基因的转基因小鼠的胚胎成纤维细胞，简称OSKM-MEF，重编程步骤为：

1.4.1.1细胞播种：胰酶消化OSKM-MEF细胞1min，抽走胰酶，加入6-7mL DMEM完全培养基，用移液器多次吹打形成充分打散的成纤维细胞悬液；用血球计数板统计成纤维细胞浓度后，稀释成纤维细胞悬液到3000个成纤维细胞/cm²，再将固定了超疏水微孔阵列芯片的培养皿中的PBS溶液抽走，迅速向超疏水微孔阵列芯片培养皿中加入12mL稀释好的成纤维细胞悬液，在CO₂培养箱中过夜培养；

1.4.1.2细胞重编程：细胞播种24h后，消化掉培养皿底部其余细胞，置换为Dox诱导培养基进行细胞重编程；整个细胞重编程培养过程中前14天用Dox诱导培养基2-3天更换一次，最后6天用KSR培养基，2天更换一次。

5.根据权利要求1所述的一种细胞重编程方法，其特征在于：当步骤1.4所述的细胞重编程为芯片上逆转录病毒诱导的小鼠成纤维细胞重编程，具体步骤为：

1.4.2.1：包装细胞准备和病毒包装：将Plat-E细胞复苏后，传代到直径为10cm的皿中；细胞汇合度到达80％准备转染，转染前1h更换为无血清的DMEM完全培养基；通过化学转染方法将编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的逆转录病毒质粒转染到Plat-E细胞中；

1.4.2.2：病毒液收集感染：转染48h后，将病毒上清用针筒抽取收集，用0.45μm滤膜过滤到离心管中，在Plat-E细胞中加入10mL DMEM完全培养基，72h后同样方法再次收集病毒液；在收集后的病毒液中按照终浓度4μg/mL比例加入polybrene，混匀；取4种病毒上清液各1ml；

将6孔板中提前复苏好的小鼠成纤维细胞，加入混合好的病毒上清，放入37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；感染过夜后，将含有病毒的培养基更换为2mL DMEM完全培养基；

1.4.2.3：细胞播种；

1.4.2.4：细胞重编程：细胞播种24h后，消化掉培养皿底部其余细胞，置换为KSR培养基，每两天换液一次，直到第二十天进行克隆挑取。