[发明专利]一种从口蹄疫疫苗样品中提取146S抗原的装置及其方法和应用

说明书

本发明提供了一种从口蹄疫疫苗样品中提取146S抗原的装置及其方法和应用；本发明提供的从口蹄疫疫苗样品中提取146S抗原的装置，集成式的实现了从口蹄疫疫苗样品抗原中萃取146S抗原，并对146S抗原进行纯化及浓缩，不仅146S损失低，还能去除对抗原检测产生干扰的杂质，尤其是对于样品中核酸杂质的去除，而现有的其他装置或方法均无法达到此效果，保持146S其生物活性的结构和含量不在提取过程中发生变化，重复提取3次测试标准偏差一般仅有0.01～0.3左右，并且获得的146S抗原可用于多种抗原检测技术。对养殖企业、疫苗生产企业、监督管理进行口蹄疫疫苗样品质量的监控与提高具有非常重要的作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种从口蹄疫疫苗样品中提取146S抗原的装置及其方法和应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是传染性最强的家畜疫病之一，发病率100％，国际动物卫生组织(OIE)将该病列在法定上报的动物传染病之首。

疫苗对动物的保护效果主要取决于疫苗中有效抗原的含量。在口蹄疫疫苗中，起到最主要的保护作用的有效抗原是其完整病毒146S抗原。然而，口蹄疫病毒146S抗原十分不稳定，在生产和运输过程中极易裂解，裂解后的产物不仅失去了原有的免疫活性，而且成为一种新的杂质，可能引起毒副作用。因此疫苗中完整病毒146S的含量直接关系到疫苗的质量，也成为企业和检验单位最关注的指标之一。《中国兽药典》二〇一五年版中口蹄疫灭活疫苗质量的最终评估标准是动物免疫攻毒试验。该方法试验费用极其昂贵，每年口蹄疫生产企业在动物攻毒试验上的费用成本高，且该方法检测误差大，还存在病毒扩散的危险，同时也涉及动物实验伦理问题。目前已有报道的用于检测口蹄疫疫苗中146S抗原的方法主要分为两类：测定146S抗原的含量或对病毒的血清型进行分析。其中，测定146S抗原含量的方法主要包括蔗糖密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法及ELISA检测法。

蔗糖密度梯度的超速离心法是过去30年中测定146S抗原含量最主要的方法。但该方法在测定口蹄疫疫苗中的146S抗原时，不能直接进行测定，而要首先对疫苗进行一系列的处理，将抗原从疫苗油乳剂中释放，并进行浓缩或纯化。例如CN102998378B中公开了一种首先用硫酸鱼精蛋白沉淀去除核酸物质纯化病毒，然后进一步用PEG6000浓缩病毒，最后再利用蔗糖密度梯度超速离心对浓缩后的病毒进行检测的方法；CN101655452A中同样公开了一种蔗糖密度梯度离心法检测146S抗原含量的方法，该方法在病毒样品中加入氯仿或三氯乙烯混合进行预处理，离心后收集病毒液进行超速离心分析。

尺寸排阻色谱法是近年来报道的用于分析口蹄疫病毒疫苗抗原的新技术，该方具有分辨率高、速度快的突出优势。其原理为基于146S抗原尺寸和大部分杂质分子尺寸的区别，在色谱柱中行走的路径长短不同从而实现分离。即使分子量不同，具有相近水力学半径的物质也会有相近的流动性。由于不同企业的疫苗生产工艺及水平不同，生产流程往往涉及大分子量的核酸、脂类、蛋白质等杂质，而尺寸排阻色谱无法将这些物质与146S区分，因此需要对疫苗进行预处理才能进行测定。例如CN104634891A公开了一种利用高效液相尺寸排阻色谱定量测定口蹄疫抗原中146S抗原含量的方法，其中对已经加入佐剂的口蹄疫疫苗需要加入正丁醇等进行破乳处理，对未经纯化的口蹄疫疫苗中间品需要加入核酸酶去除核酸对检测的干扰；CN105158130A公开了一种采用尺寸排阻层析量化口蹄疫病毒的方法，其中该方法对样品进行极性或非极性溶剂的处理用于萃取抗原，或者采用核酸酶进行预处理去除核酸干扰，或者使用PEG沉淀制备进行浓缩。

其它利用免疫学方法进行口蹄疫疫苗中146S抗原的检测方法同样涉及到先对抗原的分离、纯化、浓缩等。CN105467138B公开了一种根据免疫扩散原理进行口蹄疫疫苗组分判定及估计抗原含量的方法，该方法的步骤包括了破乳分离出抗原相及通过超滤浓缩法进行抗原浓缩。CN103091490B及CN103076451B公开了一种口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒及其使用方法，其中成品疫苗需先用破乳剂破乳、离心，吸出抗原再用ELISA方法检测。