[发明专利]一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和在产高分子量透明质酸中的应用，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus subtilis；命名为BH‑2菌株保藏编号CGMCC No.16841；该工程菌选用枯草芽孢杆菌WB600为基础菌种，向其基因组中引入了透明质酸合酶hasA基因，UDP‑葡糖脱氢酶hasB基因，UDP‑葡糖焦磷酸化酶hasC基因，维持了工程菌低蛋白酶活性的特点，并通过温度调控工程菌的生长代谢，获得了分子量为6.9×10⁶道尔顿的高分子量透明质酸，具有工业应用价值。

技术领域

本发明涉及一种透明质酸工程菌的构建方法、及其得到的工程菌，属于基因工程和微生物领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是一种存在于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中的高分子糖胺聚糖，其市场需求与日俱增。透明质酸参与许多重要的生物学过程，可广泛应用于眼科学、整形手术和化妆品等领域。目前，工业上普遍采用弱化溶血性等毒性的C型链球菌来生产透明质酸。但由于其遗传不稳定性和复杂的处理手段，使得链球菌作为发酵菌种生产HA受到限制。随着合成生物学的发展，使得利用遗传背景清楚且是公认安全菌株(如枯草芽孢杆菌等)生产HA成为可能，另外，枯草芽孢杆菌含有除透明质酸合酶(hyaluronan synthase,HAS)外透明质酸合成途径的其他全部基因，因此枯草芽孢杆菌成为构建透明质酸重组菌株的首要选择。

透明质酸生理功能与其分子量大小密切相关，不同分子量具有不同的功能，高分子量 HA(Mr2×10⁶Da)具有较好的粘弹性，可广泛应用于眼科学、整形手术和伤口愈合等方面；中分子量HA(Mr:10⁵～10⁶Da)具有良好的保湿性和润滑性，可用于药物缓解作用；低分子量HA(Mr10⁴Da)可以抑制肿瘤扩散、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，并且保湿性好，可用于临床医学、化妆品和滴眼液中的润滑剂等。有研究表明，心磷脂(cardiolipin)在细胞膜上的分布和数量在一定程度上会影响所合成的透明质酸的分子量。因此，可以通过改变心磷脂的分布和数量来改变透明质酸的分子量。

目前缺乏一种工程菌，在改变某些培养条件(如温度等)下能分别产生高分子量和中分子量透明质酸，同时不会含有大量的蛋白酶和溶血素。

发明内容

本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一株生产高分子量透明质酸的工程菌，所述工程菌的建议分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus subtilis；并命名为BH-2 菌株；该菌株已于2018年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.16841。

本发明同时提供了一种上述生产高分子量透明质酸的工程菌的构建方法，其中，包括以下步骤：

第1、含透明质酸合成途径基因共表达的片段构建

第1.1、从含乳房链球菌(Streptococcus uberis)透明质酸合酶基因hasA的合成菌株中提取基因组，利用PCR反应扩增hasA片段A，PCR引物对为hasABC-F1/hasABC-R1；从枯草芽孢杆菌WB600中提取基因组，并通过PCR方法扩增UDP-葡萄糖脱氢酶基因 hasB序列片段B和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因hasC序列片段C，PCR引物对分别为 hasABC-F2/hasABC-R2和hasABC-F3/hasABC-R3；

第1.2、将PCR产物片段A、B和C进行重叠PCR，引物对为hasABC-F1/hasABC-R3，得到hasABC片段；