[发明专利]一种甲壳素脱乙酰酶及其应用

说明书

本发明通过对不同物种的不同基因组序列进行分析研究，筛选得出了若干未知蛋白，并进一步从中鉴定出了具有出色脱乙酰酶活性的甲壳素脱乙酰酶，更具体而言，本发明涉及一种来源于油菜黄萎菌(Verticillium longisporum)Vlo的甲壳素脱乙酰酶，与已经报道的甲壳素脱乙酰酶相比，该甲壳素脱乙酰酶对生产条件要求较低，具有较高的生物安全性，并且具有更适合工业化应用的特性，表现出广泛的应用潜力。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于油菜黄萎菌(Verticilliumlongisporum)VL1的甲壳素脱乙酰酶及其应用。

背景技术

甲壳素又名几丁质，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体(D-GlcNAc)通过β-1,4糖苷键连接而成的直链高分子氨基多糖，主要存在于无脊椎动物(特别是虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳)、海藻(如绿藻)、真菌(如霉菌)等中，是除纤维素以外的又一大类重要的多糖。然而，甲壳素不溶于水、稀酸、碱、乙醇或其它有机溶剂，所以大大限制了其利用价值，而其脱去乙酰基后的产物壳聚糖取决于脱乙酰度不同，可以溶于酸及中性水溶液。由于壳聚糖具有生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良特性，因此在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域得到了广泛应用(Kaur and Dhillon 2014)。目前，生产壳聚糖主要采用的浓碱热解法(40％以上的氢氧化钠)存在诸多问题，如反应时间长、能耗大、产品质量(主要是指平均分子质量和脱乙酰度)不稳定，并会造成严重的环境污染问题。

甲壳素脱乙酰酶(Chitin deacetylase，简称CDA，E.C.3.5.1.41)可将甲壳素中的乙酰基脱除，从而使其转化为壳聚糖(Ghormade,Kulkarni et al.2010)，可有效解决传统方法制备壳聚糖存在的问题，提供了一种高品质、低成本、节能环保的壳聚糖新型生产方法。

目前，国内外已有CDA研究的若干相关报道，其产生物种包括真菌、细菌及昆虫等，其中主要来源是真菌(Zhao,Park et al.2010)。1973年，Araki等(Araki and Ito 1974)首次从接合菌纲(Zygonycetes)的鲁氏毛霉(Mucor rouxii)中发现了CDA。1982年，Kauss等(Kauss,Jeblick et al.1983)从植物病原菌菜豆炭疽菌(Colletotrichumlindemuthianum)中分离得到CDA，这是从非接合菌中发现该酶的最早报道，其最适反应温度为60℃，最适pH为偏碱性环境。随后，越来越多真菌、细菌被报道具有甲壳素脱乙酰酶活性，例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(Alfonso,Nuero et al.1995)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)(Gao,Katsumoto et al.1995)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Matsuo,Tanaka et al.2005)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Martinou,Koutsioulis et al.2002)、金针菇(Flammulina velutipes)(Yamada,Kurano etal.2008)、卷柄根霉(Rhizopus circinans)(Gauthier,Clerisse et al.2008)以及芽孢杆菌(Bacillus)(He,Xu et al.2014)(Sun,Zhang et al.2016)(Raval,Simsa et al.2017)和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)(Sun,Zhang et al.2014)。其中，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)来源的CDA表现出与野生型真菌相似的酶活力(Sun,Zhang etal.2016)。