[发明专利]用于寡核苷酸合成的双重偶联方法

说明书

本公开的各方面包括用于在寡核苷酸的合成期间使核苷亚磷酰胺双重偶联的方法。所述方法可包括经由核苷间P(III)键使核苷残基的游离羟基与受保护的核苷亚磷酰胺的第一样品偶联，随后暴露于氧化剂，然后是与所述受保护的核苷亚磷酰胺的第二样品的第二偶联步骤，并且进一步暴露于氧化剂。所述方法用于在例如平坦表面的固相载体上合成寡核苷酸中。可在寡核苷酸合成期间在一个或多个核苷酸位置处利用所述双重偶联方法，从而减小单碱基缺失率。还提供了根据所公开的方法合成的含寡核苷酸的组合物。

背景技术

传统的DNA合成包括4个步骤：亚磷酰胺偶联、未反应的羟基的封端、亚磷酸三酯氧化为磷酸三酯以及用酸除去末端二甲氧基三苯甲基。偶联步骤的失败在随后成功地封端的情况下，产生所有可能长度的短链节梯(与期望长度为n的全长寡核苷酸序列相比具有n-1、n-2、n-3等长度的寡核苷酸)。封端步骤的失败或脱三苯甲基步骤的失败产生大量的(n-1)链节，其中(n-1)杂质比全长度短一。这种(n-1)链节长度的寡核苷酸不是纯单一化合物，而是由分布在寡核苷酸的整个长度上的单碱基缺失失败组成。

为了使用自动化合成器来改进传统的亚磷酰胺化学物质在诸如受控孔玻璃的固体载体(support)上的偶联效率，常常使用“双重偶联”循环。在封端步骤之前执行传统的双重偶联循环。继而，在氧化步骤之前执行封端步骤，因为封端步骤被认为使可能在鸟嘌呤核碱基的O6位置处发生的支化副反应逆转(Pon RT,Usman N,Damha MJ,Ogilvie KK:Prevention of guanine modification and chain cleavage during the solid phasesynthesis of oligonucleotides using phosphoramidite derivatives.Nucleic AcidsRes 1986,14(16):6453-6470)。通过在封端和氧化之前重复向固体载体上的去三苯甲基化寡核苷酸添加活化剂和亚磷酰胺单体的步骤来执行双重偶联循环。在第二偶联步骤之前不执行氧化步骤，否则将失去在封端步骤期间使支化逆转的好处，因为亚磷酸三酯核苷酸间键的氧化会稳定不希望的支化寡核苷酸副产物。

发明内容

本公开的各方面包括用于在寡核苷酸的合成期间使核苷亚磷酰胺双重偶联的方法。所述方法可包括经由核苷间P(III)键使核苷残基的游离羟基与受保护的核苷亚磷酰胺的第一样品偶联，随后暴露于氧化剂，然后是与所述受保护的核苷亚磷酰胺的第二样品的第二偶联步骤，并且进一步暴露于氧化剂。所述方法可用于在诸如平坦载体表面的固相载体上合成寡核苷酸，该平坦载体表面可用于寡核苷酸阵列。可在寡核苷酸合成期间在一个或多个核苷酸位置处利用所述双重偶联方法，从而减小单碱基缺失率。也提供了根据所公开的方法合成的含寡核苷酸的组合物。

在一方面中，本公开提供了一种用于在寡核苷酸的合成期间使核苷亚磷酰胺双重偶联的方法，所述方法包括：

(a)使附着到固相载体的末端核苷残基的游离羟基与受保护的核苷亚磷酰胺的第一样品接触，以经由核苷间P(III)键使所述受保护的核苷与所述末端核苷残基偶联；

(b)在步骤(a)之后，使所述经接触的核苷残基暴露于氧化剂以氧化所述键并产生第一偶联和氧化的产物；

(c)在步骤(b)之后，使所述第一偶联和氧化的产物与所述受保护的核苷亚磷酰胺的第二样品接触，以经由核苷间P(III)键使所述受保护的核苷与所述末端核苷残基的残余游离羟基偶联；以及

(d)在步骤(c)之后，添加氧化剂以氧化所述键并产生受保护的末端核苷残基。

所述方法还可以包括：

(e)使所述末端核苷残基的受保护的羟基脱保护以产生游离羟基；以及

(f)重复步骤(a)至(e)直到所述寡核苷酸被合成为止。

在这些方法中，步骤(b)和(d)可以包括在暴露于所述氧化剂之后洗涤所述固相载体。