[发明专利]用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法

权利要求书

1.用于生产包含至少约90％单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，该方法包含：

a)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的第一混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；

b)使第一混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质级分相对于第一混合物增加；IEC步骤包含将第一混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；

c)收集来自步骤b)的IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的第二混合物；和

d)使第二混合物经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质级分相对于第二混合物增加，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。

2.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质为激素、细胞因子、酶或抗体。

3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。

4.根据上述权利要求任一项的方法，其中离子交换色谱(IEC)步骤为阴离子交换色谱(AEC)步骤。

5.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC材料具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。

6.根据上述权利要求任一项的方法，其中：

i.第一混合物包含低于25％的寡-聚乙二醇化蛋白质；和/或

ii.IEC流通溶液包含至少90％的聚乙二醇化蛋白质；和/或

iii.单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约95％、98％、99％或99.9％的单-聚乙二醇化蛋白质。

7.根据上述权利要求任一项的方法，其中步骤a)还包含进行聚乙二醇化反应，其包含使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应。

8.根据权利要求7的方法，其中聚乙二醇化反应在约7.0-9.0的pH下进行，且其中PEG/蛋白质的摩尔比约为0.6-1.0。

9.根据权利要求7或权利要求8的方法，包含

进行包含步骤a)、b)和c)的第一个循环，其中步骤b)还包含从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，得到IEC洗脱液；和

进行包含步骤a)、b)和c)的第二个循环，其中将第一个循环的步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至步骤a)的聚乙二醇化反应中。

10.根据权利要求9的方法，其中从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质使用包含小于或等于约45mM盐的洗脱缓冲液。

11.根据权利要求9或权利要求10的方法，其中该方法包含三个、四个或五个循环，且其中每个循环的步骤b)包含从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，得到IEC洗脱液，并且其中步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至下一个循环中步骤a)的聚乙二醇化反应中。

12.根据权利要求9-11任一项的方法，其中将来自循环的步骤b)的IEC洗脱液直接添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中。

13.根据权利要求9-12任一项的方法，其中将循环的步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中，并且其中还将新鲜的非-聚乙二醇化蛋白质添加至步骤a)，以便维持每个循环的步骤a)中的基本上恒定的聚乙二醇化反应条件。