[发明专利]突变的和遗传修饰的芽孢杆菌属细胞及其用于增加蛋白质产生的方法

权利要求书

1.一种亲本地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞的突变体，所述突变体包含编码变体GlcT蛋白质的glcT基因，

其中，所述变体GlcT蛋白质为亲本GlcT蛋白质的变体，其中所述亲本GlcT蛋白质来源于地衣芽孢杆菌且与SEQ ID NO:82具有至少90％序列同一性并且在SEQ ID NO:82的氨基酸位置67处为亮氨酸(L)(L67)，且

其中，相对于所述亲本GlcT蛋白质，所述变体GlcT蛋白质的差异在于在SEQ ID NO:55的氨基酸位置67处亮氨酸(L)至苯丙氨酸(F)的取代(L67F)。

2.如权利要求1所述的突变体细胞，其中所述glcT基因编码SEQ ID NO:55的变体GlcT蛋白质，且包含核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:56具有至少90％序列同一性。

3.如权利要求1所述的突变体细胞，所述突变体细胞包含引入的编码目的蛋白(POI)的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的突变体细胞，其中所述引入的编码所述POI的多核苷酸包含有效地连接的并且在编码所述POI的多核苷酸的上游(5′)的SEQ ID NO:63的mod-5′-UTR序列。

5.一种遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞，其中所述遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞源自亲本地衣芽孢杆菌细胞，所述亲本地衣芽孢杆菌细胞包含编码SEQ ID NO:82的野生型GlcT蛋白质的野生型glcT基因，其中所述遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞包含编码根据权利要求1定义的变体GlcT蛋白质的经修饰的glcT基因。

6.如权利要求5所述的遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞，其中用glcT-Cas9靶向载体修饰亲本细胞中编码SEQ ID NO:82的野生型GlcT蛋白质的野生型glcT基因，其中所述glcT-Cas9靶向载体修饰野生型glcT基因的密码子67，其中经修饰的glcT基因编码所述变体GlcT蛋白质。

7.一种遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞，其中所述遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞包含引入的编码根据权利要求1定义的变体GlcT蛋白质的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞，其中所述遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞进一步包含灭活的编码GlcT蛋白质的内源染色体glcT基因，所述GlcT蛋白质为地衣芽孢杆菌GlcT蛋白质且与SEQ ID NO:82具有至少90％序列同一性并且在SEQ ID NO:82的氨基酸位置67处为亮氨酸(L)(L67)。

9.如权利要求7所述的遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞，其中所述遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞进一步包含编码SEQ ID NO:84的RghR2蛋白质的恢复的rghR2基因(rghR2_恢复的)。

10.如权利要求7所述的遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞，所述经修饰的细胞包含引入的编码POI的多核苷酸。

11.如权利要求10所述的遗传修饰的地衣芽孢杆菌细胞，其中引入的编码所述POI的多核苷酸包含有效地连接的并且在编码所述POI的多核苷酸的上游(5′)的SEQ ID NO:63的mod-5′-UTR序列。

12.一种经修饰的地衣芽孢杆菌细胞，所述经修饰的地衣芽孢杆菌细胞源自亲本地衣芽孢杆菌细胞，所述亲本地衣芽孢杆菌细胞包含编码野生型GlcT蛋白质的glcT基因，所述野生型GlcT蛋白质在SEQ ID NO:82的氨基酸位置67处为亮氨酸(L)(L67)，其中所述经修饰的地衣芽孢杆菌细胞包含编码根据权利要求1定义的变体GlcT蛋白质的经修饰的glcT基因，

其中所述经修饰的地衣芽孢杆菌细胞相对于产生相同目的蛋白(POI)的亲本细胞产生增加量的POI。