[发明专利]使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法

说明书

本发明涉及一种使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法，优选地，涉及一种基于导致恙虫病的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamoshi)的多拷贝基因的碱基序列而提供的引物对(primer pair)，以及使用其检测恙虫病东方体以诊断恙虫病的方法。使用本发明的引物对的诊断方法比使用常规的靶基因的检测方法可以以更高的灵敏度和特异性进行检测，因此可以以高的准确度快速且容易地进行临床诊断。

技术领域

本发明涉及一种使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法，优选地，涉及一种能够扩增恙虫病东方体(Orientia tsutsugamoshi)——恙虫病的致病菌——的多拷贝基因的碱基序列的引物，以及使用所述引物诊断恙虫病的方法。

背景技术

恙虫病是一种急性发热性疾病，其由被恙虫病东方体感染的恙螨科幼虫感染，并且显示出以全身性血管炎为特征的临床表现。主要宿主是啮齿类动物，螨类动物既是宿主也是介体。自从1951年在韩国首次将其作为一种主要的秋热病报道以来，该病在韩国在9月至11月之间发生。尤其是，在韩国是一种常见病，因为在秋季30％的患者被诊断为恙虫病。

症状包括被受感染的螨幼虫叮咬后，经过1-3周的潜伏期后，初期症状伴有发烧、发冷、头痛和肌肉疼痛，在胸部、腹部、躯干或上下肢以及极少情况下在脸部或在手掌、足底出现红斑和丘疹。发病几天内在受感染的螨叮咬的皮肤上出现黑色痂覆盖的焦痂(eschar)，在大多数情况下，没有诸如疼痛或瘙痒的症状，焦痂的确认有助于快速诊断。

通常，该病程并不严重，并且对抗生素治疗反应良好，但是延迟诊断可能导致肺炎、急性肾衰竭、脑膜炎、脑炎、上消化道出血、多器官功能障碍综合征、甚至心肌炎或中风。这种并发症可能会导致某些患者死亡。

因此，快速准确的诊断对于改善患者的预后至关重要。

诊断恙虫病的方法包括：培养、分离来自患者的血液的恙虫病东方体、并在患者的血清中检测针对恙虫病东方体的抗体的方法。但是，通过培养菌体诊断疾病的方法需要数周以上的培养时间，对于诊断实际患者的目的并不合适。

在诊断中最常用的检查方法是间接免疫荧光抗体法(IFA)、被动血集反应(PHA)和免疫色谱法(Immonochromatography)。

使用这些抗体的诊断方法通常在症状发生1-2周以后被检出，因此，灵敏度非常低，且假阳性多，无助于诊断。

例如，参考图1，使用间接免疫荧光抗体法(IFA)诊断恙虫病的方法是疾病预防控制中心公开的方法之一，其在当IFA IgG抗体滴度为1∶256以上时就判定为确诊恙虫病。

但是，抗体上升并被诊断可能需要数周，并且46.7％的灵敏度相对较低，如果在症状发生1周内就医，只有所有患者的42.1％可以被诊断为恙虫病，因此需要更加快速且容易判定的新的诊断方法。

作为替代的诊断方法，已经提出了基于聚合酶链反应(PCR)的检测方法。PCR是一种可以指数地扩增DNA所需部分的拷贝(copy)数的分子生物学方法。不管是DNA的任何部分，只要知道其序列，则可以通过PCR进行扩增。

PCR方法包括以常规方式进行的常规(conventional)PCR，从常规方法改进的并且比常规PCR方法灵敏100倍的嵌套式(nested)PCR方法、以及可以实时监测(monitoring)PCR反应并且可以在2小时的短时间内确认结果的实时定量荧光(real time)PCR方法。

通常，在恙虫病的PCR诊断方法中，已经尝试了使用诸如46kDa、57kDa、groEL的各种靶蛋白基因(target protein gene)的PCR，并且主要使用嵌套式PCR和实时PCR，而不是常规PCR。在恙虫病的诊断中常规PCR的灵敏度极低，在10％内。在嵌套式PCR的情况下，可以通过进行两次PCR来提高灵敏度，但存在着比别的PCR所需的检查时间更长的缺点以及由于进行两次PCR，由基因的污染(contamination)导致假阳性率增加的缺点。