[发明专利]经由pH调节进行的荧光团多路复用

说明书

检测溶液中超过一种分析物的设备，包括至少一个与该溶液接触的电极、包括第一染料和第二染料的至少两种染料，和电化学活性剂，其中该溶液具有pH，该电极配置为通过氧化或还原电化学活性剂来调节溶液的pH，第一染料和第二染料在不同pH水平下发射荧光，第一染料的荧光用于指示第一分析物的存在，且第二染料的荧光用于指示第二分析物的存在。还提供了检测溶液中多种分析物的方法。

发明领域

本发明的方面涉及检测溶液中多种分析物的设备和方法。

背景

多路复用是一项通过减少试剂消耗和提高吞吐量来节约成本并在处理珍贵样品时广泛使用的技术。该技术在分析活检样品的应用中是有益的，所述应用如聚合酶链式反应（PCR）、用于检测单个细胞或组织样品中的特定DNA或RNA靶标的荧光原位杂交（FISH）、以及荧光抗体测定。在这些应用中，多路复用的程度通常受到具有非重叠光谱性质的荧光探针的数量和分析仪器上可用的光通道的数量的限制。

例如，通常，可以同时在一个PCR管中检测的反应数量限制为五个，主要是因为PCR仪器可以检测不超过四个或五个颜色通道，其中之一可被保留作为参考通道。实时定量PCR（qPCR）可以通过读取来自4至5种具有非重叠光谱性质的不同染料的荧光一次检测4至5种分析物。扩充每个通道的分析物数量的一种策略是组合发射最大值相同但对光漂白的荧光稳定性不同的荧光团。参见Schuler等人, F. Anal. Chem. 2016, 88 (5), 2590–2595。但是，这项技术仅能进行终点检测，因为光漂白是不可逆过程，且因此不适于qPCR。其它策略利用通过缓冲液交换、脱盐或透析来改变生物溶液的pH。但是，所有这些方法均会导致一部分样品损失或稀释，耗费时间，并且不适合反复并入qPCR过程。

概述

下面阐述了本发明的某些示例实施方案的概述。应当理解的是，呈现这些方面仅为了向读者提供这些特定实施方案的简要概述，并且这些方面并非意在限制本发明的范围。事实上，本发明可以涵盖下文中可能未阐述的多个方面。

本发明的示例实施方案通过利用有机染料的pH依赖性荧光性质增加了可以在单一样品中区分的荧光探针数量。如果两种染料在相同波长下发出荧光（即具有重叠的光谱性质），但具有明显不同的pH特性（例如，一种在酸性或碱性pH下具有更高的荧光，而另一种具有相反的pH行为或对pH变化不敏感），那么可以通过测量在两种不同pH下的信号用相同的检测器（即通道）来检测两种荧光团。通过改变溶液pH调节染料的荧光可以扩展相同数量的通道中可检测的靶标的数量。

本发明的示例实施方案利用了快速、可逆、可重复且不需要交换溶液以保持qPCR所需基本成分（例如核苷酸、盐、引物、聚合酶、荧光标记探针和DNA）的浓度（除了水合氢离子、羟基和/或缓冲离子的浓度外）的pH调节步骤。本发明的示例实施方案利用电化学pH调节，其中水合氢离子浓度因与qPCR溶液接触的电极表面发生的受控电化学反应（氧化或还原）而原位改变。这种方法能够对溶液pH实现动态控制，是可逆的，并在初始一次性添加电活性试剂后可以在整个qPCR过程中重复多次。电化学反应发生的电势低到足以防止qPCR过程的任何其它组分发生电化学变化。该限制主要由氨基酸和核苷酸对氧化/还原的稳定性来限定。参见Arrigan, D. W. M. 2007, 132, 615–632。另一限制是电活性试剂与qPCR组分的化学相容性。

美国专利号9,810,688描述了一种电化学pH调节平台，其对溶液pH提供动态的按需控制。与微流体环境结合，该pH调节技术可用于改变微流体通道内部整个溶液的pH。

在本发明的示例实施方案中，在终点PCR反应的情况下，pH仅需要在扩增过程结束时改变一次以扩展在相同通道中可检测的靶标的数量，并且该步骤无需是可逆的。