[发明专利]蛋白质的生产方法

说明书

本发明属于生物医药领域，主要提供了糖基化修饰受调节的抗原结合蛋白的制备和生产方法，包括在细胞培养周期中向培养体系添加氨基酸。可用于调节抗原结合蛋白的糖基化修饰、提高蛋白稳定性，使蛋白的补体依赖的细胞毒性作用的相关功能发生改变，并提高生产工艺的可控性和蛋白的批间一致性。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种蛋白质的制备方法和生产方法，尤其是抗体的制备方法和生产方法。

背景技术

糖基化是治疗性抗体重要的翻译后修饰，糖基化最常见两种形式为O-糖(寡糖与含羟基氨基酸如Ser、Thr或Tyr连接)及N-糖(寡糖与Asn-X-Ser/Thr连接，X为除Pro外任何氨基酸)，对于CHO细胞，N-糖基化通常位于抗体重链Fc片段(CH2区)Asn297位点。蛋白糖基化起始于内质网及高尔基体，在糖基转移酶和糖苷酶及底物作用下切除葡萄糖(Glucose)及甘露糖(Mannose)残基并连接N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、唾液酸(Sialic Acid)、岩藻糖(Fucose)、半乳糖(Galactose)等糖基团形成复杂且多样的糖型结构，这些糖型基团分布直接影响着抗体免疫原性及生物学功能(Hossler P，Khattak SF，Li ZJ.Optimal andconsistent protein glycosylation in mammalian cell culture[J].Glycobiology，2009，19(9)：936-949；Zheng K，Yarmarkovich m，Bantog C，et al.Influence ofglycosylation pattern on the molecular properties of monoclonal antibodies[J].MAbs，2014，6(3)，649-658)。其中，半乳糖基化的建立是利用半乳糖作为半乳糖基化链式反应的组成单元，通过半乳糖基转移酶将半乳糖连接于紧邻的N-乙酰葡糖胺糖，半乳糖基化修饰通过影响抗体Fc片段空间构象，增加其与Clq受体结合能力，从而达到增强补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity；CDC效应)(LIU LM.AntibodyGlycosylation and Its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics ofMonoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins[J].Journal of pharmaceuticalsciences，2015，104：1866-1884.)。

对于有补体依赖的细胞毒性(CDC)效应的抗体，增加半乳糖基化修饰可提高其CDC效应从而增强其对靶细胞杀伤作用。对于没有或不需要CDC效应(比如采用不同1gG亚型或Fc糖修饰位点改造的方式使其丧失Fc受体结合功能)的抗体，在工艺过程中控制半乳糖基化修饰同样非常重要。半乳糖基化修饰极易受上游工艺参数、培养规模、反应器材质、场地变更及原材料等多种因素影响，半乳糖基修饰的批间一致性也是衡量抗体药物生产工艺可控性及稳定性的重要指标。目前，可以通过调控上游工艺中pH、pCO2或金属离子添加剂等调节半乳糖基化修饰，但此类调控方式通常伴随其它蛋白质量及产量的降低。WO2012149197采用向完全培养基中添加锰或半乳糖的方法以调节重组表达抗体的半乳糖基化水平。抗体半乳糖基化修饰偏低及批次间不稳定在单克隆抗体药物开发中常有发生，需提供一种增加抗体半乳糖基化修饰的方法，使半乳糖基化修饰提升，同时增强工艺的可控性，提高抗体的质量。

发明内容

本发明目的至少在于提供一种制备和/或生产蛋白质的方法。在一个方面，本发明提供一种制备和/或生产糖基化受调节的蛋白方法。在另一个方面，本发明提供一种制备和/或生产糖基化受调节的抗原结合蛋白的方法，可选地，所述抗原结合蛋白是抗体或其片段。本发明的目的还在于提供一种调节蛋白质糖基化修饰的方法。在一个方面，本发明提供一种调节蛋白糖基化修饰的方法。在另一个方面，本发明提供一种调节抗原结合蛋白的糖基化修饰的方法。在又一个方面，本发明提供一种调节抗体或其片段的半乳糖基化修饰的方法。