[发明专利]具有高稳定性的可光裂解的核苷酸试剂

说明书

本发明提供了用于通过PCR和RT‑PCR(逆转录酶‑PCR)进行核酸扩增的稳定核苷酸试剂，其包含经修饰的核苷三磷酸。本发明还提供了在扩增反应中使用经修饰的核苷三磷酸检测靶核酸序列在样品中的存在或不存在的方法。

发明领域

本发明提供了稳定的核苷酸试剂、其制备方法、其使用方法以及包含它们的试剂盒。所述核苷酸试剂可用于许多重组DNA技术，尤其是通过聚合酶链反应(PCR)进行的核酸扩增。

发明背景

核酸扩增试剂一般包含温度敏感组分，且因此必须经常在远低于环境温度的温度贮藏和运输。脱氧核苷三磷酸或其核糖核苷三磷酸类似物的情况尤其如此。这些试剂易于通过从末端丧失连续的磷酸基团而降解，从而导致二磷酸核苷和核苷一磷酸的形成，它们都不再作为核酸聚合酶的底物具有活性。通过酯化末端磷酸可以显著提高核苷多磷酸的稳定性。例如，γ-甲基-dNTP类似物在足以完全降解正常dNTPs的热应激条件下是完全稳定的。然而，末端磷酸的酯化可能会对这些核苷酸充当某些聚合酶的有效底物的能力具有负面影响。存在具有既是热稳定的又最初作为底物无活性但容易通过简单步骤活化的核苷三磷酸的需要。

发明概述

本发明提供了用于通过PCR和RT-PCR (逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的热稳定核苷酸试剂，其包含具有可光裂解（photocleavable）部分的经修饰的核苷多磷酸。本发明还提供了在扩增反应中使用经修饰的核苷三磷酸检测靶核酸序列在样品中的存在或不存在的方法。

因此，在一个方面，本发明涉及一种检测样品中靶核酸序列的存在或不存在的方法，该方法包括进行扩增步骤，其包括使所述样品与扩增试剂接触以产生扩增产物，如果所述靶核酸序列存在于所述样品中的话，和检测所述扩增产物，其中所述扩增试剂包含具有可光裂解部分并具有以下结构的经修饰的核苷三磷酸：

其中碱基是嘌呤或嘧啶碱基或类似物。在一个实施方案中，在扩增步骤之前，用具有能够裂解可光裂解部分的波长的光照射所述经修饰的核苷多磷酸。在一些实施方案中，所述扩增试剂包含核酸聚合酶、缓冲液、核苷三磷酸、至少一种寡核苷酸引物、可检测地标记的寡核苷酸探针和/或染料中的至少一种。

在另一个方面，本发明涉及一种使用扩增试剂扩增靶核酸序列的方法，其中所述扩增试剂包含具有可光裂解部分并具有以下结构的经修饰的核苷三磷酸：

其中碱基是嘌呤或嘧啶碱基或类似物。在一个实施方案中，在扩增之前，用具有能够裂解可光裂解部分的波长的光照射所述经修饰的核苷三磷酸。在一些实施方案中，所述扩增试剂包含核酸聚合酶、缓冲液、核苷三磷酸、至少一种寡核苷酸引物、可检测地标记的寡核苷酸探针和/或染料中的至少一种。

在另一个方面，本发明涉及一种在扩增反应期间减少或防止核酸的非特异性扩增的方法，其包括提供用于扩增靶核酸的扩增试剂，其中所述扩增试剂包含具有可光裂解部分并具有以下结构的经修饰的核苷三磷酸：

其中碱基是嘌呤或嘧啶碱基或类似物。在一个实施方案中，在扩增之前，用具有能够裂解可光裂解部分的波长的光照射所述经修饰的核苷三磷酸。在一些实施方案中，所述扩增试剂包含核酸聚合酶、缓冲液、核苷三磷酸、至少一种寡核苷酸引物、可检测地标记的寡核苷酸探针和/或染料中的至少一种。

在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含具有可光裂解部分并具有以下结构的经修饰的核苷三磷酸：

其中碱基是嘌呤或嘧啶碱基或类似物。在一个实施方案中，所述经修饰的核苷三磷酸的特征在于与未经修饰的核苷三磷酸相比具有更大的热稳定性。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种扩增试剂，其选自核酸聚合酶、缓冲液、核苷三磷酸、至少一种寡核苷酸引物、可检测地标记的寡核苷酸探针和/或染料。