[发明专利]用于遗传工程改造克鲁维酵母宿主细胞的方法

说明书

本文提供了用于遗传工程改造克鲁维酵母(Kluyveromyces)的方法。该方法可以用于遗传工程改造克鲁维酵母以产生和分泌全长抗体或抗体片段。该发明还提供了用于产生和分泌抗体的方法。

发明领域

本文所提供的方法和组合物通常涉及分子生物学和遗传工程改造领域。

背景技术

将靶向修饰引入宿主细胞基因组的遗传工程改造技术能够用于各种领域。根本地，确定基因型如何影响表型取决于引入靶向插入或缺失以削弱或废除天然基因功能的能力。在合成生物学领域，制造能够产生感兴趣的化合物或蛋白质的遗传修饰的微生物需要将定制的DNA序列插入宿主细胞的染色体中；工业规模生产通常需要在宿主细胞基因组中引入多个基因。

对于某些宿主细胞，特别是对于常规酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，充分开发了遗传工具以进行靶向的基因组基因缺失和整合。多种非常规酵母细胞对于工业应用(例如，小分子和蛋白质生产)是有吸引力的宿主。然而，用于工程改造这些物种的工具通常很差。例如，克鲁维酵母属(genus Kluyveromyces)，特别是马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)，因其快速生长，高耐酸性和高温耐受性，对于生产工业产品和抗体是有吸引力的酵母宿主。然而，由于非同源末端连接(NHEJ)的高基础(basal)速率以及维持稳定质粒的困难，对马克斯克鲁维酵母进行靶向基因组改变历来很耗时。最近首次报道了基于CRISPR破坏马克斯克鲁维酵母中的基因，但是没有整合任何基因并且该破坏依赖于NHEJ。当前，尚未报道过马克斯克鲁维酵母中兆核酸酶介导的，靶向的，单基因组的整合或多重整合。这类整合将极大地将遗传工程改造周期时间减少至少50％。

特别希望的是使用非常规酵母细胞产生抗体。当前，在中国仓鼠卵巢(CHO)或其他哺乳动物细胞系中制备治疗目的的单克隆抗体。经过数十年的细胞系开发和工艺开发，已经实现了在12天内达到最高0.5g/L/天的生产率。从鉴定DNA构建体到提交用于小规模生产的研究用新药(IND)所需的时间约为15个月。参见Genentech网站。此外，经过数十年的改进，CHO细胞系生产率不太可能显著提高，并且随着引进对于更广泛和慢性病症(例如，阿尔茨海默氏病)的疗法，预期对单克隆抗体的需求将会激增。因此，CHO细胞存在两个问题：生产新抗体的时间线很长，和满足未来需求的能力不足。迄今为止，已经通过工程改造的酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(例如，Glycofi，购自Merck)已经产生了具有适当糖基化的全长单克隆抗体。

为了解决这些问题，需要改善用于各种克鲁维酵母宿主细胞基因组修饰的当前已知方法。本发明解决了这些和其他需求。

发明内容

本发明提供了用于修饰克鲁维酵母宿主细胞基因组中靶位点的方法。该方法包括使具有降低的非同源末端连接(NHEJ)活性的克鲁维酵母宿主细胞接触：编码核酸酶的核酸，所述核酸酶能够切割靶位点；和供体DNA分子，其能够在切割的靶位点处同源重组，从而宿主细胞中的同源重组导致供体线性核酸在靶位点处整合。然后选择其中供体DNA分子被整合到靶位点中的转化宿主细胞。

在一些实施方式中，核酸酶是RNA引导的DNA内切核酸酶，并且该方法还包括将向导RNA引入细胞，所述向导RNA能够将RNA引导的内切核酸酶引导至靶位点。向导RNA可以在含有衍生自马克斯克鲁维酵母的稳定元件的质粒上。RNA引导的DNA内切核酸酶可以是Cas9内切核酸酶。可以将编码核酸酶的核酸预先整合到基因组中。

在一些实施方式中，将向导RNA引入细胞的步骤可以通过使宿主细胞与线性核酸接触进行，所述线性核酸包含编码该向导RNA的核酸序列或该向导RNA本身。在这些实施方式中，编码向导RNA的核酸位于启动子和终止子之间，并且向导RNA由宿主细胞中的线性核酸瞬时表达。线性核酸可以包含退火的tracrRNA和crRNA寡核苷酸。