[发明专利]通过限制培养基中的氨量来提高微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性的方法

说明书

本发明涉及通过限制培养基中的氨浓度来增加给定微生物细胞耐受的邻氨基苯甲酸浓度的方法。

本发明涉及通过限制培养基中的氨浓度来增加给定微生物细胞耐受的邻氨基苯甲酸浓度的方法。

目前，没有商购可得的邻氨基苯甲酸盐或相应酸的可再生的或生物衍生的来源。当前的苯胺生产方法依赖于石油衍生原料的化学合成。与可再生的原料如可再生资源生物质相反，这种石油衍生原料是不可再生的。苯胺的化学合成是一个多步骤过程。苯胺生产中涉及的几个反应步骤导致高的生产成本。此外，常规的（即化学的）苯胺合成与危险的中间体、溶剂和废产物有关，它们能够对环境具有重大影响。芳环上的非特异性副反应导致产物收率的降低，因此进一步增加了生产成本。石油衍生原料受全球石油价格导致的成本波动的影响。

邻氨基苯甲酸和/或盐（o-aminobenzoate）是莽草酸（shikimate acid）途径的天然中间体，并且是用于芳族氨基酸L-色氨酸的生物合成的前体。WO2015/124687公开了一种以两个过程步骤生产生物衍生的苯胺的概念：(1)使用重组细菌发酵生产邻氨基苯甲酸和/或盐（o-aminobenzoate）和(2)随后将邻氨基苯甲酸催化转化为苯胺。用于所述过程中的重组细菌属于棒状杆菌（Corynebacterium）或假单胞菌（Pseudomonas）科。两种细菌在7至8的pH值下都生产邻氨基苯甲酸和/或盐。

当在7至8范围内的pH下生产邻氨基苯甲酸和/或盐时存在以下问题：由于发酵生产邻氨基苯甲酸（o-aminobenzoate），其是一种酸，需要添加碱如NH₄OH以确保稳定的中性pH。因此，产生例如NH₄⁺/邻氨基苯甲酸根^-的盐。然而，这样的邻氨基苯甲酸盐对微生物细胞是有毒的。根据图3，当达到大于25 g/L邻氨基苯甲酸根（o-aminobenzoate） (不包括阳离子的质量) 的NH₄⁺/邻氨基苯甲酸根（o-aminobenzoate）浓度时，细菌细胞的代谢活性(见OTR)受到限制，并且细胞生长(见干重)在更高浓度(＞50 g/L)下停止。对于产物如谷氨酸或赖氨酸而言，这种毒性是未知的。

这种类型的毒性问题通常通过所应用的微生物细胞的直接进化来解决。首先，在重复的分批实验或连续发酵试验中，将微生物细胞暴露于浓度增加的毒性组分(例如邻氨基苯甲酸和/或盐)。由此，微生物细胞通过随机诱变(其可以通过添加诱变剂来加速)进化，并且更耐受的微生物细胞得以存活。其次，分离/选择最耐受的细胞，并可将其用于生产。

然而，作为这些微生物细胞中的耐受性的基础的许多机制消耗能量(AindrilaMukhopadhyay，Trends in Microbiology，2015年8月，第23卷，第8号；Rau等人，Microb Cell Fact (2016) 15: 176; Warnecke T, Gill RT. Microbial Cell Factories.2005; 4: 25)。因此，消耗一定比例的可发酵底物用于维持代谢，导致邻氨基苯甲酸和/或盐的产率降低。由于这个原因，该过程的合理的空时产率所需要的邻氨基苯甲酸和/或盐的高滴度伴随地降低了产物产率。

尽管由可再生来源以生物技术生产邻氨基苯甲酸和/或盐作为用于苯胺生产的前体提供了潜在的益处，但是上述毒性因素减少了该过程的潜在益处。因此，需要用于增加微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性的替代方法。

所述问题通过权利要求书和以下的说明书中定义的实施方案来解决。

在第一实施方案中，本发明涉及用于培养至少一种微生物细胞的方法，所述微生物细胞能够在可发酵底物的存在下将可发酵底物转化为oAB，同时维持其代谢活性，其中培养基的特征在于不超过200 mM的氨浓度和至少40 g/l的邻氨基苯甲酸(oAB)浓度。