[发明专利]修饰基因组的组合物和方法

说明书

提供了用于修饰基因组DNA序列的组合物和方法。该方法在基因组DNA序列中的预定靶位点生成双链断裂(DSB)，在基因组中的靶位点导致DNA序列的突变、插入和/或缺失。组合物包括DNA构建体，其包括编码Csm1蛋白的核苷酸序列，其操作性连接至在感兴趣细胞中可操作的启动子。DNA构建体可以用于指导在预定基因组基因座的基因组DNA修饰。本文描述了使用这些DNA构建体来修饰基因组DNA序列的方法。此外，提供了用于调节基因表达的组合物和方法。组合物包括DNA构建体，其包括在感兴趣细胞中操作性的启动子，其操作性地连接至编码消除了生成DSB能力的突变型Cms1蛋白的核苷酸序列，任选地连接至调节转录活性的结构域。该方法可以用于上调或下调预定基因组基因座处的基因表达。

发明领域

本发明涉及用于在预选位置编辑基因组序列和用于调节基因表达的组合物和方法。

关于通过EFS-WEB以文本文件形式提交的序列表

序列表的正式文本通过EFS-Web以按照美国信息交换标准码(ASCII)的文本文件与说明书同时提交，文件名为BHP017P5 Sequence Listing_ST25.txt，创建日期为2018年8月3日，大小为1,848Kb。通过EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分且通过引用全文纳入本文。

背景技术

基因组DNA的修饰对于基础和应用研究是极其重要的。基因组修饰有可能说明并且在一些情况中疗愈病因，以及在包括此类修饰的个体和/或细胞中提供所需特性。基因组修饰可以包括例如植物、动物、真菌的修饰，和/或原核基因组修饰。修饰基因组DNA的最常用方法趋向于在基因组内的随机位点修饰DNA，但是最近的发现使位点特异性基因组修饰成为可能。此类技术依赖于在所需位点上产生DSB。该DSB导致将宿主细胞的原生DNA修复机制募集到DSB。可以控制DNA修复机制，以在预定位点插入异源性DNA，以使原生植物基因组DNA缺失，或以在所需位点生成点突变、插入或缺失。对于位点特异性基因组修饰特别感兴趣的是成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)核酸酶。CRISPR核酸酶使用引导分子，通常是引导RNA分子，它与核酸酶相互作用并且与靶向的DNA碱基配对，从而允许核酸酶在所需位点产生双链断裂(DSB)。DSB的产生要求原型间隔子-邻近基序(PAM)序列的存在；在PAM序列的识别之后，CRISPR核酸酶能够产生所需DSB。Cms1 CRISPR核酸酶是一类CRISPR核酸酶，相对于其它CRISPR核酸酶(例如Cas9核酸酶)具有某些所需性质。

实施基因组修饰的一个领域是植物基因组DNA的修饰。植物基因组DNA的修饰对于基础和应用植物学研究是极其重要的。具有稳定修饰的基因组DNA的转基因植物可以具有新的性状，如除草剂耐受，抗虫性，和/或积累有价值蛋白质，包括它们提供的药用蛋白质和工业酶。原生植物基因的表达可能会被上调或下调或以其他方式改变(例如，通过改变表达原生植物基因的组织)，它们的表达可能会被完全消除，DNA序列可能会被改变(例如，通过点突变、插入或缺失)，或新的非原生基因可能会被插入植物基因组，从而将新的性状赋予植物。

发明内容