[发明专利]用于细胞遗传修饰的非整合型DNA载体

说明书

本发明涉及包含至少一个启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段中，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA(SEQ ID NO：1)；本发明还涉及包含所述多核苷酸的组合物和宿主细胞，以及涉及用于医药用途和用于治疗遗传疾病的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的试剂盒和装置，以及涉及多核苷酸的方法和用途。

本发明涉及包含至少一个启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段中，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA(SEQ ID NO：1)；本发明还涉及包含所述多核苷酸的组合物和宿主细胞，以及涉及用于医学和用于治疗遗传疾病的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的试剂盒和装置，以及涉及多核苷酸的方法和用途。

出于科学目的，现代细胞培养中通常使用细胞的遗传修饰。然而，尽管非常需要，但是使用相应技术来治疗由基因突变引起的遗传疾病仍然受到以下问题的阻碍：可用的方法通常仅提供瞬时修饰，例如瞬时转染方案，而提供细胞稳定修饰的方法通常依赖转基因整合到宿主细胞的基因组中。然而，即使靶向至特定基因座，转基因的整合也具有引起有害突变的风险，这可能导致例如作为治疗副作用的癌症。

核骨架/基质附着区(S/MAR)(也称为核骨架附着区(SAR))或与基质相关的区(MAR)被称为真核生物基因组中介导核基质附着的序列。S/MARS是富AT的序列，并且发现一些富AT的基序被进一步富集(Liebeich等人(2002)，NAR 30(15)：3433)。已经提出了多种在细胞中稳定维持的基于S/MAR基序的载体，例如在US 6410314 B1和Haase等人(2010)，BMCBiotechnology 10：20中；此外，鉴定了对这种载体的复制有影响的表观遗传效应(Haase等人(2013)，PLOS One 8(11)：e79262)。然而，仍然没有足够稳定的用于基因治疗的基于S/MAR的载体。

然而，在本领域中需要用于稳定转染细胞的改进的手段和方法，特别是使用S/MAR元件并避免与将转基因整合到宿主细胞的基因组中有关的风险。该问题通过本文公开的手段和方法解决。

因此，本发明涉及包含至少一个启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA。

如下所使用的，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任意语法变体以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外，在该上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以指具有一个或多于一个其他特征的情况。例如，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”可以指除了B之外，A中不存在其他要素的情况(即，A仅由B组成的情况)，以及除了B之外，实体A中还存在一个或多于一个其他要素，例如要素C、要素C和D或甚至其他元素的情况。

此外，如下文所使用的，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与任选的特征结合使用，而不限制其他可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选特征，并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代性特征来进行。类似地，由“在本发明的实施方案中”或类似表述引入的特征旨在为任选特征，其对本发明的其他实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对将以这种方式引入的特征和本发明的其他任选或非任选特征组合的可能性也没有任何限制。