[发明专利]用酶组合物检测肌酸水平

说明书

本发明提供了允许灵敏测定特定溶液中肌酐水平的组合物和系统。还提供了通过优化检测肌酐的酶催法实时测定肌酐水平和肌酐清除率，从而可以实时监测肾脏功能。认为这在活体受试者的监测以及在用于移植的离体器官例如肾脏的监测中都是有用的。

发明领域

本发明提供了允许灵敏测定特定溶液中肌酐水平的组合物和系统。还提供了在实时测定肌酐水平和肌酐清除率中使用该组合物和系统的方法，从而可以实时监测肾脏功能。

发明背景

尽管肾脏具有许多不同的组成部分，例如肾单位和肾小球，其功能可能会个别受损，但是目前测定受试者肾脏功能的方法评估肾脏的总体功能，目前尚无法测定肾脏的哪个精确部分受到影响。这种肾脏功能的总体测量称为肾小球滤过率(GFR)，并评估肾脏从血液中清除物质(特别是肌酐)的能力。这是临床环境中常规使用的方法。

GFR通常报告为标准化为1.73m²体表面积的以ml/min为单位的值。正常的成人GFR在90ml/min/1.73m²和130ml/min/1.73m²之间。GFR恶化是评估患者慢性肾脏疾病分期的临床手段，其中GFR为15ml/min或以下时被称为晚期肾衰竭。

基于肌酐清除率的GFR计算公式为GFR(ml/min)＝尿流率·([尿]/[血浆])

尽管即使在肾功能下降的情况下，分泌的肌酐量仍保持恒定，但远端肾小管也会分泌少量肌酐。

由于肾脏不断滤过，肌酐以微摩尔浓度存在于人血中。在稳定状态的系统中，人体的骨骼肌将向血流中释放恒定量的肌酐，肾脏将通过滤过和肾小管主动分泌的组合将其从循环系统中清除。这种肾小管主动分泌在较低的功能极限处包含较大比例的肌酐清除率，并导致高估肾小球滤过率(GFR)。

在临床实践中测量肌酐

目前使用三种主要技术来测量临床样本中的肌酐浓度：(i)Jaffe反应，(ii)酶法和(iii)同位素稀释质谱法(IDMS)，后者是目前所有其他方法与之所比较的方法。

IDMS

IDMS被认为是量化现代临床生物化学中目标分析物的最准确方法。原理很简单，类似于通过标签和释放方法估算动物的野生种群。从未知数量但已知同位素组成的样本开始，然后用已知数量和同位素组成的标准液稀释样本，就可以通过测量相关同位素的最终稀释率来测定原始样本中的浓度。该方法将内部比例归一化与现代质谱的高精度和低检测限结合在一起，从而可在低偏差的情况下获得高度准确且可重现的结果。

不幸的是，进行该测定所需的方法、GC-MS设备的尺寸和成本并未使其小型化，从而无法纳入连续的在线肌酐测定中。

Jaffe反应

该检测肌酐的方法早于将其作为肾功能重要指标的认识。Max Jaffe(1841-1911)于1886年发表了苦味酸和尿肌酐的反应产物碱化后有色化合物生产的第一个正式描述，并为此命名了该检测方法。可以使用比色法或分光光度法以520nm的最大吸光度快速评估颜色变化的强度，从而快速评估样本中的肌酐含量。

不幸的是，该方法并非没有缺点，尤其是实验室之间缺乏标准化的历史，这一点已由导致开发IDMS标准的工作证明[35]。Jaffe反应也是高度非特异性的，会与人体样本中经常发现的大量内源性和外源性化合物产生假阳性或阴性，包括微量的蛋白质、葡萄糖、酮体、胆红素和某些氨基糖苷和头孢菌素抗生素。

试图针对这些进行校正实际上会给正常功能和异常功能之间的边界值带来更大的不确定性，并且自相矛盾地低估没有发现内源性干扰物的尿中肌酐浓度[37]。为了说明即使是很小的误差的影响，血清肌酐浓度绝对值仅增加20μmol也可能意味着正常功能和早期肾衰竭之间的差异。

由于这些原因，在发达国家，Jaffe方法正逐渐被酶检测所取代。