[发明专利]用于胰岛素和胰岛素类似物的序列识别的肽图谱法

说明书

本发明涉及用于诸如人胰岛素和胰岛素类似物的蛋白质的肽质量指纹术。胰岛素类似物可以改变至少一个氨基酸，这难以通过当前可用的分析方法来区分。本发明进一步允许肽的序列确认，其中该方法的运行时间为四十分钟。该方法可应用于最大为50kDa的分子。

技术领域

本发明涉及蛋白质组学和分析化学领域。更具体地，本发明涉及用于蛋白质的肽质量指纹术的开发方法，该方法用于同时确定身份和质量，这进一步允许进行肽序列确认。

背景技术

采用灵敏的仪器的使用凝胶电泳和质谱的方法因用于蛋白质的快速定量分析而闻名。这些方法包括：提取蛋白质，消化至少一部分蛋白质并制作样品，进行电泳，基于标记的肽样品中的肽通过质谱来检测样品中蛋白质在表达水平上的差异。该分析方法可用于蛋白质表达图谱的定性和定量分析。然而，该方法包括许多化学品和若干步骤，使该方法的成本巨增。因此，需要开发一种减少成本和时间的方法。

通过重组DNA技术获得的蛋白质通过肽图谱法(Peptide mapping method)来识别。肽图谱是一项有影响力的测试，其能够识别由于诸如点突变错误的事件而导致的单个氨基酸变化。肽图谱法可用于评估用于重组DNA产物的细胞的表达构建体的稳定性，和评定产物稳定性，以及确保蛋白质产物的身份，或检测蛋白质变体的存在。肽图谱还用于评估商业胰岛素产品的质量，并建立适用于筛选蛋白质(例如人胰岛素和胰岛素类似物)的肽图谱法。

US 7,622,273描述了逐步法，其中蛋白质直接结合至蛋白质微阵列(蛋白质芯片)，并随后进行化学处理/酶消化/化学消化。通过化学处理步骤进行的消化包括蛋白质变性、还原和烷基化。酶消化步骤包括使蛋白质去糖基化或去磷酸化和酶水解或化学水解蛋白质。为了快速进行蛋白质识别和结构表征，蛋白质微阵列上的所有反应均逐步进行。尽管该方法比耗时约24小时的传统方法花费更少的时间，但是仍然不能令人满意。更重要的是，复杂的样品(血浆、尿液、脑脊液等)在实施该方法之前可能需要进行分馏以获得靶蛋白分离物，从而增加了整体处理和持续时间。因此，导致样品制备和预期结果需要额外的成本和时间。

US 9,581,601描述了一种通过包含两个或更多个磺酰基基团的化合物使肽/蛋白质衍生的方法，并且在质谱仪的负操作模式下对衍生的分析物进行分析。该方法允许对长链肽/蛋白质的氨基酸序列进行分析。该方法还涉及衍生化合物5-甲酰基-苯-1,3-二磺酸的合成过程。新试剂的衍生非常耗时，并且具有与之相关的附加的成本。

常规脱盐一次允许检测单个片段，并且需要进行多次色谱运行，随后再对收集的单个峰进行脱盐。该方法花费最多两个工作日。

迄今为止，文献中可用的用于胰岛素及其类似物的肽图谱过程属于基于盐的方法，该方法与LC-MS的使用不兼容。因此，需要开发一种新的肽指纹图谱法(peptidemapping fingerprinting method)，该方法具有较短的运行时间并且与LC-MS兼容。由于胰岛素类似物相差1至3个氨基酸，因此难以以时间有效的方式进行蛋白质作图，尤其是这种肽。

因此，仍然需要一种不仅减少产生的时间和成本，而且提供可靠结果的方法。

发明目的

因此，本发明的目的是提供一种用于确定蛋白质/肽的身份和质量的时间和成本有效的肽指纹图谱法。

本发明的另一个目的是提供一种方法，其中该方法将蛋白质溶解在非盐缓冲液中，与常规方法相比，这导致运行时间大大减少。

本发明的另一个目的是提供一种方法，其中该方法还允许同时检测多个片段。

本发明的另一个目的是通过消除脱盐步骤并减少分析样品所需的时间来提供序列确认。

发明内容