[发明专利]使用高效液相层析及差分折射测定检测器量化3,6-脱水-L-半乳糖的方法

说明书

本发明涉及一种使用高效液相层析及差分折射测定检测器来量化3,6‑脱水‑L‑半乳糖的方法，由此可通过控制高效液相层析/差分折射测定检测器的分离条件来独立地量化作为琼脂糖或琼脂的糖化产物的L‑AHG和D‑半乳糖，即使所述两种材料由于具有类似的分子量和结构而难以分离。

技术领域

本发明涉及一种通过使用配备有折射率检测器的高效液相层析来量化作为琼脂糖或琼脂的糖化产物的3,6-脱水-L-半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖(D-Galactose)的单糖混合物中的3,6-脱水-L-半乳糖的方法。

背景技术

构成红藻的细胞壁多糖的典型实例为纤维素、木聚糖、甘露聚糖、琼脂以及角叉菜胶。构成红藻细胞壁的外层和壁空间的黏稠多糖的主要组分为琼脂。琼脂为琼脂糖(约80％)和琼脂胶(约20％)的混合物，所述琼脂糖和琼脂胶不是由单糖形成的多糖。琼脂多糖中的琼脂糖的比例视海藻的种类而变化，且平均占80％。

琼脂多糖为其中两种单糖经由α-1,3键(α-1,3-linkage)和β-1,4键(β-1,4-linkage)交替地键结的聚合物，两种单糖即D-半乳糖(D-Galactose)及3,6-脱水-L-半乳糖((3,6-anhydro-L-galactose,L-AHG)。在这些当中，3,6-脱水-L-半乳糖据报导具有诸如抗氧化、抗发炎、增白以及抗癌效果等多种生理活性，且可被广泛用于如食品和医药材料的食品和医药工业。另外，已被注册为装饰原料的3,6-脱水-L-半乳糖可应用于作为具有增白功能的物质的装饰材料。

因此，当前需要一种经由酶反应制备具有多种生理活性的3,6-脱水半乳糖的方法及其量化方法。作为琼脂糖的酶水解的常规上已知的方法，存在一种方法，首先经由Aga16B的反应自琼脂糖聚合物制备新琼寡糖，其为内型β-琼脂水解酶(endo-typeβ-agarase)，经由Aga50D的反应制备新琼二糖，其为外型β-琼脂水解酶(exo-typeβ-agarase)，以及最后经由新琼二糖水解酶(NABH)反应制备L-AHG和D-半乳糖。使用间苯二酚(resorcinol)和蒽酮(anthrone)的着色剂经由显色反应来量化L-AHG和D-半乳糖。然而，这些方法为不利的，因为样本处理复杂，用于分析的制备时间长且准确性低(Yaphe W.(1960).分析化学,32(10),1327-1330；松广B等人(1983).碳水化合物研究,118,276-279)。作为另一方法，存在一种经由气相层析法的使用管柱内部的单独化合物的滞留时间差的分析方法，其广泛用于混合物的分离分析(Jol CN等人(1999).分析生物化学,268(2),213-222；Hama Y等人(1998).分析生物化学,265(1),42-48；Ye FT等人2006.植物化学成分分析,17(6),379-383)。然而，上述文献并未描述单糖和多糖的分离或单糖当中的L-AHG和D-半乳糖的直接分析，且描述了由于这些具有类似的分子量和结构，因此在混合时难以独立地量化两种材料。作为描述这些材料的独立量化的专利文献，存在第2011-0072958号韩国专利公开案，其揭示“使用糖噬菌体降解物2-40的粗酶来酶制备3,6-无水-L-半乳糖和来自琼脂的半乳糖及3,6-无水-L-半乳糖的定量分析方法”。然而，此方法为不利的，因为通过使用气相层析质谱的分析方法难以得出样本的衍生率，暴露于在衍生期间产生的热量导致L-AHG变性，其在热稳定性方面较弱，使得难以测量L-AHG的准确数量，且应使用昂贵的质谱仪和昂贵的衍生样本。

发明内容

技术问题

本发明的目标是提供一种量化来自在琼脂糖或琼脂的糖化中制备的单糖的混合物的3,6-脱水-L-半乳糖的方法。

技术方案

为了实现上述目标，本发明提供一种量化方法，所述方法包含通过使用配备有折射率检测器的高效液相层析量化包含半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的分析样本中的3,6-脱水-L-半乳糖，