[发明专利]树突状细胞的成熟

说明书

本发明涉及体外制备成熟树突状细胞的方法、树突状细胞成熟混合物、在体外制备抗原呈递成熟树突状细胞的方法、制备含有成熟树突状细胞的疫苗的方法，根据所述方法制备的抗原呈递成熟树突状细胞、含有抗原呈递成熟树突状细胞的疫苗以及本发明的抗原呈递成熟细胞的治疗方法和应用。

背景技术

树突状细胞(DC)是有效的抗原呈递细胞，可连接先天和后天免疫系统。作为B、T淋巴细胞和NK细胞的有效刺激物，它们对于免疫应答的发生、特异性和调节起至关重要的作用(Banchereau和Steinman(1998))。在外周组织中，发现它们处于未成熟的状态，准备好摄取、处理和表达抗原。一旦遇到抗原并对其进行处理，树突状细胞就会急剧转化为成熟细胞。在此过程中，抗原被呈递给其他免疫功能细胞，诱导免疫反应。具体而言，成熟的树突状细胞向引流的次级淋巴器官迁移，在这里它们与T细胞、B细胞和NK细胞相互作用(Mellman和Steinman(2001))。本申请人表明了，可以利用树突状细胞的抗原呈递能力，从而在体内靶向和根除癌症和其他传染性疾病的可能性。

本申请人开发了一种针对癌症和传染病的树突状细胞疫苗。在本发明中，一种利用树突状细胞成熟混合物在体外成熟树突状细胞(DC)的方法被用于癌症和传染病的免疫治疗干预，其中，所述树突状细胞成熟混合物包含Toll样受体(TLR)-3激动剂(安普利近)(Ampligen)、白介素(IL)-1β(IL-1β)、干扰素(IFN)-α、IFN-γ、CD40L和TLR-7/8激动剂(R848)。尽管使用树突状细胞作为抗癌疫苗并不是一种新疗法，但是成熟剂在此之前还没有被描述过。

本申请人还具有体外临床前证据，表明上述树突状细胞疫苗可杀灭癌细胞。使用本发明的成熟混合物成熟的树突状细胞表现出最佳的成熟表型，该表型可以极化针对癌细胞的抗肿瘤T辅助反应。本申请人进一步提供了证据证明，这些成熟的细胞产生高水平的Th1效应细胞因子，IFN-γ和IL-12p70，这是树突状细胞疫苗在体内激活和诱导抗肿瘤Th1CD8+T细胞反应的能力的指标(Curtsinger et al.(1999),Schmidt and Mescher(1999),Xiao et al.(2009)).此外，IL-12p70已被证明在调节CD8+效应子功能，T细胞活化中必不可少，并且已被证明是乳腺癌患者更有利的临床结果的关键指标(Curtsinger etal.(1999),Schmidt andMescher(1999),Xiao et al.(2009),Kristensen et al.(2012))。

本发明的主要优点是申请人开发了一种模范化的成熟方法和成熟混合物，可以容易地应用于其他类型的癌症和传染病。所述成熟混合物可以与研究者希望靶向的癌症或传染病抗原结合使用。目前的技术是安全的，可以直接转移到其他疾病。

发明内容

在本发明的第一方面中，提供了一种体外产生成熟树突状细胞的方法，该方法包括(i)在Toll样受体3(TLR-3)激动剂、IFN-α、IFN-γ、CD40L、IL-1β和Toll样受体7/8(TLR-7/8)激动剂的存在下培养未成熟树突状细胞的步骤。

在本发明的一个实施方式中，所述TLR-3激动剂是(ritatolimod)，所述TLR-7/8激动剂是R848。所述TLR-3激动剂也可以是高分子量dsRNA聚合物，选自poly[I]:poly[CxU]；poly[I]:poly[GxU]；poly[A]:poly[UxC]；poly[A]:poly[UxG]；poly[U]:poly[AxC]；poly[U]:poly[IxU]；poly[C]:poly[GxA]；poly[C]:poly[GxU]；poly[G]:poly[CxA]和poly[G]:poly[CxU]，其中x是通常3到40之间的数，最好是6到20之间的数。更优选地，所述dsRNA聚合物可以选自poly[I]:poly[C12U]和poly[C]:poly[I12U]。

在本发明的第二实施方式中，从外周血单核细胞样本培养未成熟树突状细胞。值得注意的是，该样本是从人或动物身上分离出来的。