[发明专利]生物样品的成像方法和相应的探针

说明书

使用显微镜的生物样品的成像方法，例如荧光光学显微镜、电子显微镜或关联显微镜，其提供了使用成像探针来获得图像，在图像中可能可以识别成像探针和/或与它们相关的分子。本发明还涉及可以功能化的成像探针，所述探针可以用于CLEM实验和免疫细胞化学实验中。

技术领域

本发明的制剂涉及使用可用于显微镜，特别是荧光光学显微镜、电子显微镜或关联显微镜(CLEM光电关联显微镜)，中的成像探针对生物样品进行成像的方法。

此处和下文中，成像我们指获取生物样品或其一部分(例如细胞)的图像，其中可以识别成像探针和/或与之相关的分子。

本发明还涉及用于通过显微镜对生物样品进行实验的成像探针，例如免疫细胞化学实验或鉴定目标特定分子的实验。

背景技术

CLEM是生物领域的主要显微镜技术之一，因为它通常可以可视化、识别和跟踪生物样品中特定分子在由几十微米到几纳米定义的空间尺度上的运动。

该技术结合了荧光光学显微镜(FOM)和透射电子显微镜(TEM)的优势，从而能够高精度地在生物样品中定位目标特定分子。

其他电子显微镜技术提供了进行免疫细胞化学实验的机会，在该特定领域中也称为免疫金，在纳米尺度上定位生物样品中的特定抗原。

在这些实验中，使用的探针通常由胶体金纳米颗粒与能识别并结合特定抗原的抗体或蛋白质共轭而成。

在这种情况下，变得有必要能够使用可用于CLEM并进行免疫细胞化学实验的探针，以使高精度检测特定分子而不会在生物样品中产生假象和/或改变。

由量子点或量子棒组成的探针是已知的，或者由与电子致密纳米颗粒(例如，具有约1nm直径的金纳米颗粒，在该特定领域中也称为“纳米金”)共轭的荧光团组成的组合探针。

尽管此类探针能够穿透生物样品中可能存在的单个细胞内部，但使用TEM很难检测，需要通过称为银或金增强的吸积通道。

这种吸积通道需要在一种或多种还原剂存在下，使用银盐或金盐的溶液，这需要添加非特异性贡献，这使得获得的图像解释有问题。

其他CLEM探针利用与之关联的分子荧光，以将联苯胺的衍生物，二氨基联苯胺(DAB)光转换为DAB聚合物，形成TEM清晰可见的亲锇性沉淀。

但是，如果要通过电子显微镜进行双重免疫定位，则这些探针需要使用由抗生物素蛋白和生物素化的过氧化物酶组成的复合物，这些复合物通过与第一抗体结合而氧化DAB，使其具有亲锇性，因此对于TEM可见。

从能量角度和成本角度来看，这都是昂贵的，因为它需要较长的操作时间。

作为光转化的替代，也可以通过与过氧化物酶共轭的探针，特别是辣根过氧化物酶(HRP)，来生产DAB亲锇性聚合物。

与“纳米金”不同，HRP酶不仅保持其大小不变，而且对pH、温度和压力条件敏感。

这意味着HRP酶不能渗透到单个细胞内部，相对于其所在的环境条件，它经常会发生变性。

因此，与HRP酶共轭的探针必须恒定地保持在受控环境中。

一些已知的解决方案提供了使用包括掺杂有能够与特定分子偶联的发光离子的晶格的无机纳米颗粒，以允许在生物样品中对其进行检测。

例如，文献EP-A-1.801.593提供了使用复杂的无机纳米粒子，例如无机盐、氧化物或半导体的晶格，承载了激活发光的稀土阳离子或过渡金属。

由于与生物样品成分的典型尺寸相比尺寸较大，这些已知的晶格可能潜在地干扰与其相关的特定分子以及生物样品本身。

此外，这些已知的晶格通常具有高毒性，因此可以显著改变生物样品的行为。