[发明专利]基因疗法DNA载体VTvaf17、生成方法；大肠杆菌菌株SCS110-AF、生成方法；携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17、生成方法

权利要求书

1.用于动物和人细胞的遗传修饰的3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17，其含有核苷酸序列SEQ ID No.1。

2.构建3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17的方法，该方法包括首先构建4182bp载体，然后通过SpeI限制性位点将它切割，并且将剩余的片段与其自身连接，该4182bp载体含有具有内在增强子的人延伸因子EF1A的1188bp启动子区、具有限制性内切核酸酶BamHI、EcoRV、SaII、HindIII、KpnI、EcoRI的位点的35bp多接头、人生长因子的466bp转录终止子和多腺苷酸化序列、允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的136bp调节元件RNA-OUT、具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中的载体生成的用于自主复制的1299bp复制起点、1010bp卡那霉素抗性基因。

3.大肠杆菌菌株SCS110-AF，其用于生成基因疗法DNA载体VTvaf17或允许无抗生素的阳性选择的基于它的基因疗法DNA载体。

4.获得大肠杆菌菌株SCS110-AF以生成基因疗法DNA载体VTvaf17或基于它的基因疗法DNA载体的方法，该方法包括构建64bp的线性DNA片段，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并挑选出在含10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆，该线性DNA片段含有允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的调节元件RNA-IN、1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB、挑出发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR和确保与基因失活同时的基因recA区域中的同源重组的两个同源序列329bp和233bp，所述1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB的产物确保在含蔗糖的培养基内的选择。

5.大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号B-12990，国际保存机构编号NCIMB 42801登记)，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17以用于允许无抗生素的选择的其进一步生成。

6.获得携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AFA/Tvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号B-12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)的方法，其包括制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并且用基因疗法DNA载体VTvaf17对这些细胞进行电穿孔，之后，将细胞倒入具有含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素。