[发明专利]解决扩增反应中低效的方法和组合物

说明书

减少扩增反应中扩增偏倚和引物二聚体形成和在单个反应中从样品扩增多个靶多核苷酸并对靶多核苷酸测序的方法和系统，其中样品可以包括法医样品并且其中靶多核苷酸可以包括身份信息告知性或祖先信息告知性标记、短串联重复序列(STR)和单核苷酸多态性(SNP)。确定核苷酸间隔区序列以破坏引物二聚体形成的方法可以包括：接收引物序列集合；确定引物序列的接头序列和基因特异性部分之间的多个候选间隔区，确定的多个候选间隔区包含破坏引物序列集合的序列之间稳定相互作用的序列；对延伸序列中符合稳定相互作用预定阈值的候选间隔区排序；和输出符合预定阈值的定序间隔区集合。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年6月20日提交的美国临时专利申请号62/522,543的优先权，所述文献的内容内容通过引用方式完整并入本文。

序列表

本申请含有已经通过电子方式以ASCII格式提交并因而通过引用方式完整并入的序列表。2018年6月7日创建的所述ASCII拷贝命名为IP-1448-PCT_SL.txt并且大小为121,820比特。

背景技术

在扩增反应例如聚合酶链反应或PCR反应期间，可向反应中引入偏倚。例如，某些扩增引物可能彼此相互作用，导致引物二聚体形成。引物二聚体因为彼此杂交而非与其靶序列杂交的引物共有的互补碱基而形成。引物二聚体也将在扩增反应期间扩增，因而竞争扩增试剂，并在最差情况场景下，抑制靶的扩增。定量PCR或qPCR期间引物二聚体形成时，这将大大影响运行这些类型的扩增反应时尽力寻求的准确度。

一些引物可能与它们靶向的序列并非100％同源，例如在引物和它在核酸序列上结合的位置之间存在一个或多个序列错配。由于扩增效率依赖序列，错配可能造成偏倚扩增并且在靶扩增中导致移向甚至不以可检测方式扩增的靶点。从而，扩增偏倚可能大大影响扩增反应的准确度。

通常在分析犯罪现场采集的样品时或为确定个体群体的DNA图谱进行DNA剖析。传统的DNA剖析方法涉及大小分离技术，如在电泳系统上区分并比较含有STR或ITR的基因组片段。最近，已经引入涉及从样品PCR扩增DNA，随后进行下一代测序的DNA剖析方法，如存在于PCT专利公开号WO2015/126766中。当处理多重扩增产物，每种产物代表一种靶时，生成可测序的文库可能非常复杂。例如，如果需要探查200个靶，则发生200个靶的扩增，每个扩增需要一个引物集合，从而总计有400个不同的扩增引物。这种复杂系统可能导致不良反应，所述不良反应可能降低扩增反应的效率并因此降低所得文库用于测序的效率。另外，不良反应可能导致所需的靶最低限度存在或根本不扩增，因此对探查至关重要的靶可能丢失或降低到结果不可信的程度。当扩增反应(如上文描述用于DNA剖析的那种扩增反应)中存在巨大数目引物时可能发生的不良反应之一是形成引物二聚体。

以下公开描述了纠正或最小化可能导致扩增反应(例如复杂的多重扩增反应)的引物二聚体不良反应的方法和组合物。纠正或最小化引物二聚体的结果提供了更高效和稳健的靶特异性扩增系统，例如DNA法医鉴定、指纹分析需求、qPCR和其中需要高程度扩增准确性的其他扩增反应。

发明简述

在附图和下文描述中叙述一个或多个实施方案的详细内容。其他特征、目的和优点将从说明书、附图和权利要求显而易见。

本公开涉及减少扩增反应中扩增偏倚和引物二聚体形成的方法、组合物和试剂盒。本文还提供在单个反应中从样品扩增多个靶多核苷酸并对靶多核苷酸测序的方法。