[发明专利]通过限制至少两种限制性营养源增强脂质的产生

说明书

本发明涉及在脂质产生细胞发酵期间通过限制至少两种限制性营养源而增强脂质产生的方法。

本发明涉及通过在脂质产生细胞发酵期间限制至少两种限制性营养源而增强脂质产生的方法。

某些真核微生物(例如藻类；真菌，包括酵母；及原生生物)已被证实是在发酵罐中多不饱和脂肪酸的良好生产者。特别地，已经示出当首先将菌株培养至高细胞密度时，并且第二步通过降低培养基中限制性营养源如氮源的量或者降低溶解氧的量而起始增强的脂质产生，可以实现产生大量的PUFA(多不饱和脂肪酸)(WO 01/54510)。

从这种现有技术出发，本发明的目的是提供一种方法，其进一步提高多不饱和脂肪酸的产量。

令人惊讶地发现，在脂质产生细胞发酵过程中如果不仅降低一种限制性营养源的量，而且另外降低另一种限制性营养源的量，可以实现更高产量的PUFA，其中那些限制性营养源优选是氮源和磷酸盐源。

因此，本发明的第一个主题是一种从微生物优选真核微生物产生含有多不饱和脂肪酸的脂质的方法，所述微生物能产生的脂质是其生物质的至少大约10wt.-％，所述方法包括生物质密度增加阶段和脂质产生阶段，包括：

a)在所述生物质密度增加阶段，以足以使含有所述微生物的发酵培养基的生物质密度增加至至少50g/L的速度，向所述发酵培养基中加入碳源和至少两种限制性营养源，以及

b)在所述脂质产生阶段，停止或显著降低至少两种所述限制性营养源的供应，同时仍保持碳源的供应。

如本文所用，术语“限制性营养源”是指微生物的生长和细胞分裂所必需的营养物的来源(包括营养物本身)，当生长培养基中耗竭所述限制性营养物时，其缺乏实质上限制了微生物进一步生长或复制。但是，由于其它营养物(和碳源)仍然丰富，因此生物体可以继续产生和积累细胞内和/或细胞外产物，特别是脂质。

这种限制性营养源包括氮源，磷酸盐源，维生素源(例如维生素B2源，泛酸源，硫胺素源)，微量金属源(例如锌源，铜源，钴源，镍源，铁源，锰源，钼源)和主要金属源(例如镁源，钙源，钠源，钾源)，二氧化硅源及其混合物。

所述微量金属源和主要金属源包括这些金属的硫酸盐和氯化盐(如MgSO₄*7H₂O，MnCl₂*4H₂O，ZnSO₄*7H₂O，CoCl₂*6H₂O，Na₂MoO₄*2H₂O，CuSO₄*5H₂O，NiSO₄*6H₂O，FeSO₄*7H₂O，CaCl₂，K₂SO₄，KCI和Na₂SO₄)及其混合物。

在本发明的一个优选实施方案中，所述“至少两种限制性营养源”是氮源和磷酸盐源。在这个优选实施方案中，除了所述一或多种氮源和一或多种磷酸盐源外，在脂质产生阶段也可以停止或显著减少另外限制性营养源的供应，但优选其它限制性营养源在脂质产生阶段中大量存在。

因此，本发明的一个优选主题是一种从微生物、优选真核微生物产生含有多不饱和脂肪酸的脂质的方法，所述微生物能产生的脂质是其生物质的至少大约10wt.-％，所述方法包括生物质密度增加阶段和脂质产生阶段，包括

a)在所述生物质密度增加阶段，以足以使含有所述微生物的发酵培养基的生物质密度增加至至少50g/L的速率向所述发酵培养基中加入碳源和至少两种限制性营养源；和

b)在所述脂质产生阶段，停止或显著减少至少两种所述限制性营养源的供应，同时仍保持碳源的供应，其中所述至少两种限制性营养源是氮源和磷酸盐源。