[发明专利]血色素结合蛋白制剂

说明书

总的说来本发明涉及纯化的血色素结合蛋白的稳定液体制剂及其用途，该制剂包含：(a)含量为至少50mg/mL的血色素结合蛋白；(b)至少15mM磷酸盐缓冲剂；(c)5.8‑8的pH；以及(d)至少50mM氯化钠。

技术领域

本发明一般涉及血色素结合蛋白的稳定液体制剂及其用途。

背景

溶血以红细胞破坏为特征并且是与红细胞异常相关的贫血病症的标志，所述的红细胞异常例如酶缺陷、血红蛋白病、遗传性球形红细胞增多症、阵发性夜间血红蛋白尿症和刺细胞贫血，以及外源因素例如脾肿大、自身免疫性病症(例如，新生儿溶血病)、遗传性疾病(例如，镰状细胞病或G6PD缺乏)、微血管病性溶血、革兰氏阳性细菌感染(例如，链球菌、肠道球菌和葡萄球菌)、寄生虫感染(例如，疟原虫)、毒素和创伤(例如烧伤)。溶血也是一种常见的输血病症，特别是大量输血和在使用体外心肺维持的患者中。

患有与溶血相关病症的患者中可见的不良反应主要归因于从红细胞释放铁和含铁化合物，例如血红蛋白(Hb)和血红素。在生理条件下，释放的血红蛋白被可溶性蛋白质例如触珠蛋白结合，并转运到巨噬细胞和肝细胞。然而，当溶血发生加快且性质上变成病理性的时，触珠蛋白的缓冲能力被压倒。因此，血红蛋白被快速氧化成铁血红蛋白，其依次释放游离血红素(包含原卟啉IX和铁)。虽然血红素在一些生物进程中起决定作用(例如，作为必需蛋白质例如血红蛋白和肌红蛋白的一部分)，但是游离血红素是高毒性的。游离血红素是氧化还原活性铁的来源，其产生损害类脂膜、蛋白质和核苷酸的高毒性活性氧种类(ROS)。血红素的毒性由于其插入类脂膜的能力而进一步加剧，在类脂膜中血红素引起膜组分氧化且促进细胞溶解和死亡。

连续低水平细胞外Hb/血红素暴露的进化压力已导致补偿机制，该机制可控制在生理稳态条件下和轻度溶血过程中游离Hb/血红素的不良反应。这些系统包括释放一组结合Hb或血红素的血浆蛋白，包括Hb清除剂触珠蛋白(Hp)和血红素清除剂蛋白血色素结合蛋白(Hpx)和α1微球蛋白。

血色素结合蛋白是61kDa血浆β-1B-糖蛋白，其由439个氨基酸长的肽链组成，该链由两个四叶β螺旋结构域组成，类似于两个以90°角彼此锁定在一起的厚圆盘，并且如图1所示通过结构域间接头肽连接(Mauk，2011；Protein Science，第20卷，pp.791-805)。由于血管内和血管外溶血作用而释放到血液中的血红素结合在由结构域间接头肽形成的袋中的两个四叶β螺旋桨结构域之间。残基His213和His266与血红素铁原子配位，得到稳定的双组氨酰基复合物，类似于血红蛋白。

血色素结合蛋白含有约20％的碳水化合物，包括唾液酸、甘露糖、半乳糖和葡萄糖胺。在蛋白质序列中发现了十二个半胱氨酸残基，可能占六个二硫键。血色素结合蛋白代表针对血红素毒性的一线防御，这归因于它以高亲和力(K_d＜1pM)地结合血红素并作为从血流到肝脏的血红素特异性载体起作用的能力。它以等摩尔比结合血红素，但是没有证据表明血红素与该蛋白质共价结合。

除血红素结合外，血色素结合蛋白制剂据报导还具有丝氨酸蛋白酶活性(Lin等人，2016；Molecular Medicine 22：22-31，2016)和其他几种功能，例如抗炎活性和促炎活性、抑制细胞粘附和某些二价金属离子的结合。

尽管内源性血色素结合蛋白可以控制生理性稳态条件下游离血红素的不利影响，但在病理生理条件下(例如与溶血有关的那些条件下)几乎没有维持稳态血红素水平的作用，其中高水平的血红素会导致内源性血色素结合蛋白耗竭，从而引起血红素介导的氧化组织损伤。研究表明，在溶血性疾病(例如镰状细胞病(SCD)和β地中海贫血)的实验小鼠模型中，血红素结合蛋输注可减轻血红素诱导的内皮激活、炎症和氧化损伤。还显示血色素结合蛋白施用可显著降低促炎细胞因子的水平，并抵消溶血动物中血红素诱导的血管收缩。然而，尽管纯化的血色素结合蛋白显示出重要的治疗潜能，但其作为液体制剂的稳定性差。

本公开通过提供适合于治疗用途的稳定血色素结合蛋白液体制剂解决或至少部分缓解了上述问题。