[发明专利]用于制备可移植性软骨组织的方法

说明书

本发明涉及用于通过从软骨细胞或球状体中进行选择和挑选来制备软骨组织的方法，以及所述软骨组织作为药用组合物、药物、移植物的用途。特别地，本发明涉及用于鉴定合适的软骨细胞以便制备软骨组织(其特别地为了移植目的)的标志物。

说明书

本发明涉及用于通过从软骨细胞或球状体中进行选择和挑选来制备软骨组织的方法，以及所述软骨组织作为药用组合物、药物或移植物的用途。特别地，本发明涉及用于鉴定合适的软骨细胞以便制备软骨组织(其特别地为了移植目的)的标志物。

虽然关节软骨显示出值得注意的抵抗能力，但是该组织不具有或具有非常低的进行自我修复和再生的能力，而且未治疗的损害可以导致例如骨关节炎。这种低的进行自发再生的潜力导致细胞疗法(例如，自体软骨细胞移植(ACT))的发展，以力求提供功能性的和无痛的关节软骨缺陷的修复。存在高的对于用于软骨再生的方法的需求，例如在具有创伤性损害或甚至具有软骨退化症状的年轻的有活力的患者中，或者为了治疗软骨缺陷。

用人软骨细胞的生物化学和分子研究受到一系列因素的阻碍，例如与非常少数目的在活组织检查中可用的细胞相联系的人组织的可得性不足，经培养的软骨细胞的有限的增殖能力和高的表型不稳定性。

软骨细胞是一种来源于成软骨细胞并定居在软骨组织中的细胞。与细胞间质(细胞外基质(ECM))一起，软骨细胞构成软骨，特别是关节软骨的主要组成部分。

已经知道，通过模拟胚胎发育的某些过程，例如在琼脂糖基底上三维地培养人软骨细胞，从而产生在其分化状态方面优于单层细胞并且具有例如软骨样特性的细胞聚集体。尽可能准确地反映了天然骨关节组织的这些特性以胶原II(透明软骨的细胞外基质的主要结构蛋白质)、蛋白聚糖(例如，聚集蛋白聚糖)和细胞内的软骨细胞特异性的蛋白S100的表达为特征。

此外，希望的是，在以单层培养物的细胞扩增期期间必然被上调的胶原I的表达在细胞聚集体中重又降低，这是因为这种蛋白质在天然关节软骨中不存在。自2002年以来，如此产生的细胞聚集体(球状体)已被申请人用于在年轻患者中处理和治疗由损伤引起的软骨缺陷。为此，从患者中取出本身的关节软骨组织，更确切地说，从健康的软骨区域中取出透明软骨的活组织检查物。通过用胶原酶溶液酶促消化软骨组织而分离出位于软骨组织中的软骨细胞并使其通过标准细胞培养条件在细胞培养瓶中(单层培养物)在自体血清存在下进行扩增，并且提供足够的软骨细胞以供制备可移植性软骨组织使用。经扩增的细胞形成细胞聚集体(所谓的球状体)，其可以被移植。然而，如此制备出的细胞聚集体在其分化状态方面受到限制，并且大多数显示出重要的胶原II的相对弱的局部表达和蛋白聚糖的处于边缘的合成，而不希望的胶原I则有相对强的表达。为了进一步改善这些细胞聚集体的分化，可以用某些生物活性物质使培养基丰富。这首要地包括多次在文献中被描述为关于胶原合成的辅因子的生长因子TGF-β1-3以及L-抗坏血酸(维生素C)。但是，一方面，这种生物化学刺激常常不足以诱导在3D细胞聚集体中的软骨细胞分化至产生软骨典型的构造的程度，和另一方面，生长因子例如TGF-β的使用特别地对于在人中的临床应用来说是值得怀疑的。

在DE 100 13 223中已经描述了以三维细胞聚集体的形式(例如以球状体的形式)的人细胞的培养，以用于在人中的临床应用，例如作为自体软骨移植物，并且涉及用于在体外从骨干细胞、软骨干细胞或间充质干细胞制备三维软骨组织和骨组织的方法。在该情况下，将细胞首先以单层培养物进行培养，随后以悬浮液培养如此长的时间，直至产生细胞聚集体，其包含至少40体积％的细胞外基质，在其中包埋有经分化的细胞。

在所述方法中，通过将细胞在涂覆有琼脂糖的细胞培养容器中培养至少1-2周来制备细胞聚集体。

US 7,887,843 B2公开了一种用于在体外产生三维软骨组织和骨组织的方法，其中通过将1×10⁵个细胞培养至少两周来从骨干细胞、软骨干细胞或间充质干细胞制备可移植性球状体。