[发明专利]制备用于光谱法的生物样品期间的湿度稳定化

说明书

本发明提出了制备用于光谱法的生物样品，所述生物样品含有人或动物来源的细胞结构和/或全细胞(例如薄的人和动物组织切片)或原核生物(例如微生物)，并且在湿度由饱和物质溶液、例如合适的盐溶液决定的温度受控的气体量中需要恒定的相对湿度。本发明利用称为“潮解”的物理化学现象，潮解本身体现在当维持规定温度时以高精确度保持饱和物质溶液上方的相对湿度恒定。纯琥珀酸例如在约99％相对湿度下展现出潮解。因为可利用多种易潮解盐和其它合适物质，所以可能发现适合于几乎任何所需相对湿度的物质，必要时调整温度。

技术领域

本发明涉及在制备用于光谱分析的原核生物和人或动物来源细胞的样品，例如用于用成像质谱分析进行分析的人和动物组织样品期间周围气体中的相对湿度的稳定化。举例来说：包括薄的人和动物组织切片中的连接蛋白的酶促分解与化学固定(例如甲醛固定)的制备要求高湿度以供组织膨胀，这是酶发挥作用所必需的。同时，在这个过程中应该尽可能少地凝结，以便除膨胀外不会不利地影响图像的空间分辨率。

背景技术

在病理学中，常用的程序是用甲醛固定组织样品，以防组织样品自我消化，并将其包埋于不溶于水的物质、通常石蜡中，以保护组织样品抵抗细菌。以这种方式制成可储存的数百万的充分表征的FFPE组织样品(FFPE＝福尔马林固定、石蜡包埋)储存于病理学研究所和部门中。

这些样品代表了用于薄组织切片的自学分类方法和其它分析的无穷来源，尤其是使用成像质谱分析法。然而，薄组织切片中蛋白质的连接必须再次打破，并且大蛋白质首先也必须碎裂以使其可检测。这可以借助于例如酶促消化进行，不过应避免组织中消化物分子通过在过量液体中的扩散进行侧向输送，以维持蛋白质的位置准确度，因此维持图像的空间分辨率。

制备FFPE薄组织切片的常用方法包含以下步骤：(a)将切片安放至试样载片或样品支撑物上；(b)去除石蜡；(c)“抗原修复”，主要是热处理或其它能量处理以部分地打开福尔马林诱发的交联；(d)喷射酶(在消化缓冲液、通常碳酸氢铵中)；(e)在潮湿气氛中培育；(f)干燥；(g)喷射基质溶液；以及(h)测量(参见例如EP 1 695 062 B1；《通过质谱分析来分析化学交联的组织样品(Analysis of chemically cross-linked tissue samples bymass spectroscopy)》,C.Conklin和P.J.Parks)。

薄组织切片借助于胰蛋白酶的酶促消化例如需要薄切片具有高水分含量，即高度膨胀，以便所施加的酶能够弥漫至薄切片中并发挥作用。这可以在周围空气具有相对高水平的湿度时实现，不过其应该保持低于露点，因为液体在薄组织切片上不受控制的凝结会立马引起分子侧向输送，并且可能大幅度地降低成像质谱分析的空间分辨率。所述湿度水平可能必须维持数小时，并且最佳结果可能需要长达20小时的消化时间，这取决于温度，温度通常设定在37℃与50℃之间。

然而，薄组织切片的蛋白质或其它分子的酶促消化不限于甲醛固定的组织样品。有待借助于使用基质辅助激光解吸的电离(MALDI)或另一电离/检测方法分析的极大分子的消化也可以适合于未固定的薄组织切片。其还可以用于通过酶促消化从蛋白质去除残余聚糖，随后测量释放的残余聚糖。

如图1中示意性地展示，质谱图像质量随着样品制备期间湿度增加而以增加速率改善，直至当达到100％相对湿度的露点时图像质量急剧下降。图像质量是图像对比度、图像的空间分辨率和其它参数的复杂混合物，而图像质量下降主要可归于图像空间分辨率的丧失。图像的空间分辨率下降主要由分析物分子在薄组织切片中或薄组织切片上通过在液体中扩散而侧向输送引起。为了使组织中所含的分析物分子完全可获取并具有最大可能的位置准确度，因此在此实例中使用尽可能靠近100％的相对湿度并且不超出此限制是非常重要的。在当前使用的方法下进行控制是非常困难的，因为在大约100％的湿度下，温度最轻微的不均匀性或潮湿箱的动态效应就会引起不可控制的凝结。