[发明专利]具有改善的铁硫簇递送的细胞工厂

说明书

本发明提供了一种能够改善铁硫簇递送的经遗传修饰的细菌细胞，其特征在于编码突变的铁硫簇调节因子(IscR)的经修饰的基因以及编码增强生物素、硫辛酸或硫胺素的生物合成的多肽的一种或多种转基因。本发明提供了一种使用本发明的经遗传修饰的细菌生产生物素、硫辛酸或硫胺素的方法；以及所述经遗传修饰的细菌细胞在生产生物素、硫辛酸或硫胺素中的应用。

技术领域

本发明涉及能够改善铁硫簇递送的经遗传修饰的细菌细胞，其特征在于编码突变的铁硫簇调节因子(IscR)的经修饰的基因以及编码增强生物素、硫辛酸或硫胺素的生物合成的多肽的一种或多种转基因。本发明还涉及一种使用本发明的经遗传修饰的细菌生产生物素、硫辛酸或硫胺素的方法；以及所述经遗传修饰的细菌细胞在生产生物素、硫辛酸或硫胺素中的用途。

背景技术

生物素(又称为维生素B7或维生素H)和硫胺素(又称为维生素B1)是人类必需的饮食维生素，因为人类与其他后生动物一样不能产生生物素或硫胺素。硫辛酸(LA)是一种含硫的类维生素抗氧化剂，其在细菌、植物和动物中少量合成。这三种都被广泛用作饮食补充剂。目前，这些维生素或类维生素化合物的生产依赖于化学合成，这是昂贵的。制造它们的生物合成方法将提供一种替代性的、更具成本效益的方式来满足当前和未来的需求。

生物素是催化某些羧化反应的酶(例如乙酰辅酶A羧化酶(ACC))的必需辅因子。ACC存在于所有生命形式中，其产生丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A是脂肪酸生物合成的关键组成要素。在自然界中，生物素是通过涉及脂肪酸生物合成途径的线性途径合成的。大肠杆菌(E.coli)中生物素合成的最初底物是丙二酰-ACP，它也是脂肪酸合成的起始代谢物。在进入脂肪酸循环之前，丙二酰-ACP被SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶BioC掩盖，从而生成丙二酰-ACP甲酯。随后，两轮脂肪酸链延长反应产生了庚二酰基酯-ACP分子。庚二酰基酯-ACP的O-甲基被专门的酯酶BioH水解，使该分子退出脂肪酸延伸循环。

随后，中间体庚二酰基酯-ACP通过生物素特异性途径转化为生物素(图1A)。在该途径中，BioF催化庚二酰-ACP与丙氨酸的PLP依赖性脱羧醛醇缩合反应，生成KAPA(8-氨基-7-氧代壬酸)。BioA(和BioK)催化KAPA的PLP依赖性转氨作用，生成DAPA(7,8-二氨基壬酸)，其中供体为SAM；以及副产物S-腺苷-氧代甲硫氨酸。BioD催化ATP驱动的羧化反应和DAPA的闭环反应，以在脱硫生物素(DTB)中形成噻吩烷环。生物素合成途径的最后一步是已知的最复杂的反应之一，因为它涉及通过BioB(生物素合酶)在两种烃之间引入硫桥，以产生生物素。BioB是S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)自由基酶，被发现为二聚体，并在其活性位点包含两个铁硫簇：[2Fe-2S]²⁺和[4Fe-4S]²⁺。认为在DTB中形成噻吩烷环所需的硫原子是从BioB的[2Fe-2S]²⁺簇中募集的。结果，DTB的合成中所消耗的BioB二聚体中的铁硫簇被认为在每一轮催化后都再生。

硫辛酸(LA)不仅是强效的活性氧物质清除剂(因此是一种重要的抗氧化剂)，还是α-酮酸脱氢酶的辅因子。LA是从脂肪酸代谢的中间体从新合成的(图2)。参与大肠杆菌的LA合成的三种酶是LplA(硫辛酸-蛋白连接酶)、LipB(辛酰蛋白ACP载体蛋白：蛋白转移酶)和LipA(硫辛酸合酶)。由lplA基因编码的LplA能够以ATP依赖性方式催化外源辛酸与靶酶的E2亚基的未硫辛酰化的脱辅硫辛酰基结构域的结合。由lipB基因编码的LipB能够催化辛酰基残基从ACP转移到靶酶的E2亚基的脱辅硫辛酰基结构域。AceF基因编码丙酮酸脱氢酶的E2亚基的硫辛酰基结构域。由lipA基因编码的LipA负责形成两个C-S键。LipA驱动的反应需要铁硫簇(4Fe-4S)和SAM(由metK基因产生)来执行其功能。硫辛酸主要作为多种多酶复合体中的与蛋白结合的硫辛酰胺部分存在于细胞中。